背景:原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在所有恶性肿瘤中排第四位,死亡率排第二位。原发性肝癌分为肝细胞癌、肝内胆管癌及混合性肝细胞癌-胆管癌三种病理类型,其中75%～85%为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,因此,对于我国的医学工作者来说,研究肝细胞癌的病理机制及防治策略具有迫切的临床需求。目前,肝癌的治疗手段多样,但治疗效果却始终未见显著性提高。肝癌术后5年高达70%患者出现复发转移,虽然靶向免疫治疗对部分肝癌患者带来了希望,但目前客观缓解率（Objective response rate,ORR）仍较低,总人群ORR仅为12.6%～31.8%,并且有部分患者表现出治疗抵抗。始终有一个问题困扰临床医生,肝癌细胞就像一个“智慧有机体”,可以通过细胞外环境的变化不断适应、调整自己,使其具有高度的侵袭能力而不断在机体复发转移。那么,肝癌细胞是如何感知它面临的细胞外环境（包括医学治疗措施）并不断维持其高侵袭转移特性的呢?正如“种子土壤学说”,肝癌是由肝癌细胞、相关基质细胞及细胞外基质组成,肝癌高侵袭转移特性与肝癌细胞的肿瘤微环境密切相关,其侵袭转移并不完全取决于肝癌细胞本身突变或由肝癌细胞自发启动,反而几乎总是从肝癌细胞附近相关基质中接收异常信号触发,激活胞内多个侵袭转移通路而发生的。可以说,肝癌细胞侵袭转移是肝癌细胞对其周围环境的应答过程,是细胞外分子通过胞内效应分子的作用过程,但其具体分子机制还未完全阐释清楚。纤连蛋白（fibronectin,FN）是细胞外基质的重要成分之一,是一类重要的细胞外大分子糖蛋白,通过一些短肽序列（如RGD序列）与细胞表面某些整合素受体结合,进而将胞外信息传递给细胞内效应分子而发挥生物学作用。其中,Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白4（Fibronectin type III domain-containing protein 4,FNDC4）就具有这种分子功能,它属于含有纤连蛋白III型结构域蛋白质家族,胞外结构域可被切割分泌入细胞外基质中,并将细胞外信号传递给细胞内相应效应分子而发挥生物学作用。Bosma M等在Nature Communications中报道,FNDC4作为一种抗炎因子,作用于巨噬细胞降低促炎趋化因子表达,能够降低小鼠结肠炎症反应。Wuensch T等在分析结直肠癌（CRC）患者粘膜样本中发现FNDC4表达明显升高。研究报道,FNDC4的RGD序列与integrinβ1作用激活粘着斑激酶而促进骨骼肌衍生细胞迁移,与Wnt/β-catenin信号通路的胞膜LRP6受体相互作用而影响C2C12细胞分化,FNDC4也可作为一种细胞外因子,作用于人内脏脂肪细胞而减少脂肪生成及脂肪褐变。FNDC4在肝组织中高表达,而它是否作为细胞外分子诱导或促进肝细胞癌侵袭转移及可能的机制还未见报道,因此我们拟进行相关的实验研究。如前所述,FNDC4作为细胞外因子,它在肝细胞癌侵袭转移中的作用是需要通过胞内效应分子才能实现的。目前涉及肿瘤细胞侵袭转移的胞内分子机制已有相当多的研究,最终大多集中在Rho GTPases家族调控细胞骨架重塑上,其中Rac1激活介导伪足形成是肿瘤细胞侵袭转移的重要机制。T淋巴瘤侵袭和转移基因1（T-lymphoma invasion and metastasis 1,Tiam1）于1995年明确为Rac1特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）,所以Tiam1通过组成特异性的Tiam1/Rac1通路而发挥广泛的生物学功能,包括过表达会引起广泛的膜皱折和伪足形成,促进细胞迁移等。研究报道,Tiam1在包括肝癌等多种实体瘤中高表达,并与转移密切相关。然而,Tiam1既可以促进肿瘤迁移,也可以促进粘附而拮抗肿瘤迁移,这种看似矛盾的作用主要取决于肿瘤细胞类型、Tiam1细胞内定位及细胞外分子的诱导作用等,其中Tiam1胞膜定位是决定Tiam1/Rac1活性的关键环节,受到包括PI3K/Akt信号通路的调控。而FNDC4作为细胞外炎症分子,是否参与肝细胞癌侵袭迁移过程,其分子机制与胞内效应分子Tiam1/Rac1作用是否相关,目前还未见报道。为了深入研究FNDC4在肝细胞癌侵袭转移中的作用及分子机制,我们提出如下研究设想:我们推测FNDC4可能作为细胞外炎症分子参与了肝细胞癌侵袭转移的调控;其机制可能是FNDC4通过作用于细胞表面受体,激活PI3K/Akt信号通路,诱导Tiam1向肝癌细胞膜富集,Tiam1富集在胞膜处更有助于激活Rac1,从而促进Rac1介导侵袭性伪足形成,最终增强肝细胞癌侵袭转移。目的:1.通过数据库分析探讨FNDC4在肝细胞癌中的表达情况,并检测临床肝癌组织标本验证FNDC4与肝癌临床病例特征的关系,这为后续实验提供研究依据及临床价值。2.明确FNDC4在肝细胞癌侵袭转移中的作用,探讨FNDC4促进肝细胞癌侵袭转移的作用机制,验证FNDC4胞外域影响PI3K/Akt通路活性,这将阐明FNDC4促进肝细胞癌侵袭转移的胞外作用机制。3.阐明FNDC4通过PI3K/Akt通路促进肝细胞癌侵袭转移的胞内效应机制;证实PI3K/Akt通路影响Tiam1膜富集,从而促进Rac1介导伪足形成的胞内机制。4.在临床标本及动物水平上再次验证FNDC4具有调控Tiam1/Rac1活性而促进肝细胞癌侵袭转移的作用。方法:1.通过Human Protein Atlas数据库检索Fibronectin、FN等关键词,使用GEPIA数据库进行多基因比较分析,并结合TCGA数据库进行生存分析探索FNDC4蛋白及m RNA的表达与肝细胞癌的关系。采用IHC检测HCC组织芯片中FNDC4表达情况,根据染色强度分为高表达FNDC4组和低表达FNDC4组,统计分析FNDC4与两组肿瘤病理特点及临床特征的关系。2.通过外源性过表达或干扰FNDC4,以及TGF-β1刺激内源性高表达FNDC4,采用Transwell、划痕实验观察对Hep G2（低侵袭性肝癌细胞）和Hu H-7（高侵袭性肝癌细胞）细胞侵袭迁移的影响。明确FNDC4功能作用后,对FNDC4过表达Hu H-7细胞和对照细胞蛋白裂解液进行人源蛋白溶液label free定量分析,通过GO及KEGG数据库分析探究FNDC4作用机制,再采用外源性过表达或抑制FNDC4和内源性刺激FNDC4增加,Western blot检测Akt磷酸化水平验证分析结果。最后,对Hu H-7细胞转染FNDC4Δ1-188胞外截体、Δ168-234胞内截体质粒及用过表达FNDC4细胞培养基转移实验模拟胞外分子作用,Western blot检测Akt磷酸化情况,验证FNDC4胞外域影响Akt磷酸化水平而增强肝细胞癌侵袭转移。3.首先,筛选适宜的实验细胞。Western blot、q PCR方法检测肝癌细胞系Tiam1表达水平,确定过表达Tiam1质粒转染Hep G2、PLC/PRF/5细胞,Hu H-7和MHCCLM3细胞行si RNA干扰实验。接着,我们使用PI3K抑制剂LY294002处理Hep G2 Tiam1FLAG细胞,在0h/6h/12h/24h分别提取膜蛋白,Western blot检测膜蛋白中Tiam1表达。使用Akt特异性激活剂SC79、PIP5K1A过表达上调PIP2及Neomycin抑制PIP2活性,Rac1pull-down、Dot blot、Western blot检测PIP2、胞膜Tiam1、胞质Rac1-GTP及cortactin表达水平。最后,通过IF、Transwell、划痕实验等再次验证FNDC4可能通过胞内效应分子Tiam1促进Rac1介导伪足形成增强肝癌细胞侵袭迁移。4.将两个独立时间段HCC临床病例作为2个独立队列统计分析,通过基于FNDC4、Tiam1、cortactin组织芯片IHC分析,证实细胞外分子FNDC4与胞内效应分子Tiam1在临床病例中具有相关性。最后使用过表达FNDC4和Tiam1的Hu H-7细胞对裸鼠原位肝成瘤实验,4周后统计裸鼠肝脏表面肿瘤数目及大小,裸鼠肝癌组织IHC分析,在动物整体水平证实FNDC4能够上调胞内效应分子Tiam1活性而促进肝细胞癌侵袭迁移。结果1.Human Protein Atlas及GEPIA数据库分析提示FNDC4在蛋白及m RNA水平与肝细胞癌均具有相关性。TCGA数据库分析显示,FNDC4高表达组生存率显著低于低表达组（p=0.0059）,提示FNDC4可能在肝癌中发挥了重要作用。在HCC组织标本中检测到FNDC4呈差异化表达,并且主要表达在细胞外基质中,胞质和胞膜仅有少量分布,证实FNDC4属于胞外基质分子。在205例HCC患者中,FNDC4高表达与组织分化（8.8%VS.69.3%VS.21.9%,p=0.018）,微血管侵袭（36.6%VS.63.4%,p=0.035）显著相关,FNDC4高表达组与总生存期缩短（p=0.002）显著相关,而患者肿瘤复发可能性更高（p=0.0277）,临床病例生存分析结果与TCGA数据库结果基本一致。2.过表达FNDC4慢病毒转染Hep G2和Hu H-7细胞,m RNA水平上调了约140%和170%,而esi RNA干扰率分别达到约40%和50%。FNDC4干扰后对Hep G2和Hu H-7细胞体外迁移和侵袭能力产生相当大的抑制作用,而过表达FNDC4后细胞迁移和侵袭能力显著增加。TGF-β1刺激Hu H-7细胞后内源性FNDC4表达显著增加,其细胞迁移和侵袭能力也显著增强。蛋白质谱检测FNDC4过表达组Hu H-7细胞有1124种蛋白表达上调,有1351种蛋白表达下调,通过数据库分析,主要影响膜相关蛋白,并与PI3K/Akt通路密切相关。再通过实验验证,干扰FNDC4表达,Western blot检测Akt磷酸化水平显著降低,而外源性或内源性增加FNDC4表达,均显著提高Akt磷酸化水平。而在截体实验中,Western Blot检测到FNDC4全长及胞外截体组Akt磷酸化水平显著增加,而胞内截体组没有明显变化,而培养基转移实验中实验组Akt磷酸化水平显著增加,从而证实FNDC4胞外域影响细胞PI3K/Akt通路活性。3.胞内效应分子Tiam1在Hep G2、PLC/PRF/5细胞中低表达,Hu H-7和MHCCLM3细胞中高表达,确定过表达Tiam1质粒转染Hep G2、PLC/PRF/5细胞,Hu H-7和MHCCLM3细胞行si RNA干扰实验。在LY294002处理Hep G2 Tiam1FLAG细胞后,其Tiam1膜定位表达逐渐减弱,24h达到最低值,对照组胞膜Tiam1含量基本保持稳定。过表达PIP5K1A后细胞PIP2浓度增加,同时Tiam1膜含量增加,Neomycin抑制PIP2后,Tiam1膜含量降低。SC79处理细胞后,p Akt及Rac1-GTP表达水平均增加,用SC79处理已被LY294002处理过的Hep G2 Tiam1FLAG细胞,p Akt、cortactin及Rac1-GTP表达水平恢复到几乎正常的水平。上调PIP2或过表达Tiam1FLAG,Rac1-GTP/Rac1比率及cortactin水平显著增高（p＜0.01）,而抑制PIP2或sh Tiam1干扰后,Rac1-GTP/Rac1比率及cortactin水平显著减低（p＜0.01）。过表达FNDC4及Tiam1FLAG后,Hu H-7细胞伪足形成数量明显增加,过表达Tiam1质粒诱导PLC/PRF/5细胞迁移和侵袭显着增加,而sh Tiam1干扰后对细胞迁移和侵袭产生抑制作用。4.临床病例统计分析FNDC4与Tiam1、Tiam1与Cortactin均高表达的患者术后5年生存率低,FNDC4与Tiam1、Tiam1与Cortactin表达均具有显著正相关。动物实验中,过表达FNDC4和Tiam1组裸鼠肿瘤相对侵袭力高于对照组（n=8,p＜0.05）,并且在FNDC4过表达的裸鼠肝癌切片中,观察到癌灶中癌细胞明显向周围组织侵袭,其Tiam1表达水平也明显增强。结论:1.数据库及临床病例分析都证实FNDC4高表达与肝癌组织微血管侵袭呈正相关,并与HCC患者不良预后显著相关,证实了FNDC4在HCC病理过程中具有重要作用。2.FNDC4在体外能促进肝癌细胞侵袭迁移;并通过质谱分析、截体转染及培养基转移实验等证实了FNDC4胞外域影响肝癌细胞PI3K/Akt活性。但FNDC4与PI3K/Akt作用机制阐释还不够透彻。我们推测FNDC4可能通过胞外域与胞膜受体结合,从而将细胞外信号传导到细胞内影响PI3K/Akt活性。相关研究工作有待后续深入推进。3.PI3K/Akt通路在PIP2协同作用下影响胞内Tiam1分子胞膜富集,有助于激活Rac1介导细胞伪足形成,从而增强肝细胞癌侵袭转移。本部分结论主要阐释了FNDC4通过激活PI3K/Akt通路后增强肝细胞癌侵袭转移的胞内分子效应机制。4.从临床病例分析及动物体内整体实验验证了细胞外分子FNDC4可通过胞内效应分子Tiam1促进肝细胞癌侵袭转移。本研究通过提出问题,层层推进解决问题的思路,首次提出并证实了FNDC4通过其胞外域影响PI3K/Akt通路活性,促进了胞内效应分子Tiam1在PIP2协同下实现胞膜富集,Tiam1胞膜定位更利于Rac1激活,从而诱导Rac1依赖性细胞侵袭性伪足形成,最终增强肝细胞癌侵袭转移的分子机制。本研究发现将进一步丰富细胞外基质通过调控胞内效应分子影响肿瘤细胞侵袭转移的理论,也为将来可通过改变细胞外基质逆转肝癌侵袭转移提供方向。