论文部分内容阅读
背景：2015年《Lancet》全球疾病负担研究发现高血压是全球疾病负担的第三位的重要风险因素。高血压患病率约为20%，全球约有10亿患者，《J Clin Hypertens (Greenwich)》报道2010年有940万人因高血压死亡。2018年《Circulation》发布了中国高血压现状：按照2010版中国指南标准，18岁以上人群中高血压发病率为23.2%（约2.45亿人），处于高血压前期的占41.3%（约4.35亿人）。高血压损伤脑微血管。脑出血是高血压最严重的并发症之一：20%-30%的脑卒中为自发性脑出血，其中高血压性脑出血高达80%。高血压还可导致脑动脉硬化、微血管管壁病增厚、管腔狭窄、减少局部脑血流量，而影响认知功能。舒张压每增加10mmHg可增加8%的认知功能损伤程度。此外舒张压升高还与患者焦虑、抑郁症状相关。已有研究显示：长期大量酒精摄入可使血压升高，是高血压的危险因素之一；限制饮酒是降低高血压的有效干预方式之一。《J Am Heart Assoc.》2018年报道：男性任何饮酒量与高血压风险增加有关，女性每天饮酒超过2杯会增加高血压风险。《Lancet》2016年报道：中国女性饮酒率上升至16%，男性饮酒率上升至48%，因饮酒导致的死亡数量居世界第一。
酒精性高血压脑损伤的机制至今仍不清楚。脑神经血管单元（neurovascular unit, NVU）由血管细胞（内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞）、胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞与小胶质细胞）和神经元组成，对维持血脑屏障（blood-brain barrier， BBB）完整性与正常脑功能至关重要。目前，尚未见有关从NVU角度研究酒精性高血压脑损伤的报道。本论文不仅利用常规的行为、形态、生化等技术研究酒精性高血压脑损伤的特点，也利用了基于高分辨质谱的蛋白组学技术检测酒精性高血压大鼠NVU 的差异蛋白。而且数据分析过程中，在采用通用分析策略的同时，结合脑细胞类型蛋白质组学数据库、脑血管细胞类型数据库、血管生成因子与血管生成抑制因子PCR 芯片、STRING 数据库、VarElect 数据库、AlzData 数据库，以获得更为全面的酒精性高血压大鼠NVU的差异蛋白信息。
蛋白水解酶家族成员基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在血管重塑、细胞迁移和细胞外基质蛋白与粘附分子的加工过程中起重要作用。MMP2与高血压相关，高血压患者心脏及循环血液中 MMP2 显著上调。MMP2 活性增加可水解多种细胞外基质蛋白导致高血压内皮功能障碍，还可降解内皮型一氧化氮合酶或辅助因子造成血管内皮功能受损。抑制 MMP2 可以改善肾性高血压大鼠、胰岛素抵抗大鼠与妊娠导致的血压升高，改善其内皮功能紊乱。MMP2在酒精性高血压脑损伤中的作用尚不清楚。
目的：1.使用嗜酒精大鼠（alcohol-preferring rat，P鼠）建立酒精性高血压大鼠（alcoholic hypertensive rats, AH大鼠）模型，结合行为、形态、生化、蛋白组学等技术，研究AH大鼠脑损伤特点。2. 探究MMP2在AH大鼠认知障碍中的作用。
主要研究方法：
1. 实验动物及处理 65只3月龄P鼠按相似雌雄性别比例随机分为3组：蒸馏水灌胃组（Con组，n=18）、5%酒精（ethanol, EtOH）灌胃组（5% EtOH组，n=20）与30%酒精灌胃组（30% EtOH组，n=27）。30% EtOH组根据体重灌胃13ml/kg/day的30%EtOH，Con组与5% EtOH组分别灌胃等体积的蒸馏水或5%EtOH。
为研究抑制MMP2对AH大鼠的影响，3月龄P鼠（n=30）随机分为2组：Con组（n=8）与30% EtOH组（n=22,13ml/kg/day）。4周慢性酒精暴露并进行行为学检测后30% EtOH组大鼠随机分为2组（30% EtOH+Veh, n=8; 30% EtOH+SB-3CT, n=14）分别接受等体积的溶剂或SB-3CT（25mg/kg/day, MMP2/9选择性抑制剂）腹腔注射1周。
2. 血压测量及行为学检测
2.1 血压测量 采用非侵袭性血压测量方法尾压法（Tail-cuff 法）检测各组大鼠上午8:00-12:00am的收缩压（Systolic blood pressure, SBP）、舒张压（Diastolic blood pressure, DBP)与平均动脉压（Mean blood pressure, MBP）。
2.2认知相关检测使用水迷宫（Morris water maze test, MWMT）评价P鼠空间认知，学习阶段逃逸潜伏期反应空间学习能力，记忆检测阶段穿越平台次数反应了动物的空间记忆能力。在新事物识别实验（novel object recognition test, NORT）中使用辨别指数评价P鼠认知记忆。
2.3情绪相关检测使用旷场实验（Open field test, OFT）总运动距离与中央区时间分别评价P鼠自发活动与焦虑。使用高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）开放臂滞留时间百分比与进入次数评价P鼠焦虑。
抑郁使用OFT、糖水偏好实验（Sucrose preference test, SPT）、强迫游泳实验（Forced swimming test, FST）共同评价。SPT糖水消耗百分比下降反应快感缺失，FST中静止不动时间反应绝望。
3. NVU制备 使用冷蔗糖缓冲液离心方法分离富集P鼠脑NVU，并结合形态学进行鉴定，发现分离成分为结构完整的保留了与相邻细胞相互作用的 NVU。同时， NVU蛋白质组学结果中具备组成NVU细胞类型内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞与神经元特异性标志蛋白，这些结果表明成功分离富集了NVU。
4.蛋白质组学分析使用基于同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）技术的蛋白质组学技术检测并筛选NVU差异蛋白。差异蛋白阈值定义为：t-test统计学p＜0.05，30% EtOH组相比Con组变化倍数大于1.2倍为上调，小于0.83为下调。使用基因本论（Gene Ontology, GO）从细胞组成、分子功能、生物进程与 KEGG 通路进行通用分析。为全面深入挖掘酒精性高血压大鼠NVU的差异蛋白信息，使用脑细胞类型蛋白质组学数据库与脑血管细胞类型数据库分析差异蛋白表达细胞类型；STRING 数据库进行互作网络分析， Cytosacpe软件MCODE插件进行功能聚类及可视化；使用VarElect数据库批量查询差异蛋白功能；使用 VarElect 数据库及血管生成因子与血管生成抑制因子 PCR 芯片分析血管生成相关差异蛋白；使用AlzData数据库分析与老年痴呆（Alzheimers disease, AD）相关差异蛋白。
5.形态学检测使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyante,FITC）灌注脑血管评价BBB、β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老、HE染色（Hematoxylin and eosin stain）与Masson染色检测病理学改变。此外还使用免疫荧光（Immunofluorescence）检测了海马MMP2水平，使用免疫组织化学（Immunohistochemistry）检测了脑微血管密度、神经元数量、小胶质细胞与星形胶质细胞活化等。
6.免疫印迹（Western blotting, WB）与免疫酶联吸附反应（The sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）使用ELISA检测MMP2、氧化应激及促炎细胞因子水平，使用WB检测组织MMP2、MMP9、突触相关蛋白及tau蛋白等。
结果：
1.慢性酒精暴露建立AH大鼠模型慢性酒精暴露4周内30% EtOH组大鼠血液酒精浓度（blood ethanol concentration, BEC）均大于100mg/dl且前3周依次上升，至第3周达到峰值177.8±20mg/dl，而5% EtOH组4周内BEC均小于100mg/dl。
慢性酒精暴露造模前各组大鼠血压水平相似，30% EtOH组大鼠自第2周开始SBP、DBP与MBP显著上升（分别上升至149.7±3.5、121.2±3.4与130.3±3.4mmHg），并在造模第3、4周进一步上升。而5% EtOH组大鼠SBP、DBP、MBP与Con组相似，分别在120-123、90-101、99-109mmHg内波动。停止酒精灌胃处理后第11天30%EtOH组大鼠（AH大鼠）SBP、DBP与MBP相比Con与5% EtOH组依旧显著上升，说明30%EtOH暴露诱导的酒精性高血压可持续维持。
2.AH大鼠出现情感与认知障碍在EPM中30% EtOH组大鼠在开放臂滞留时间百分比为13±1.5%，明显低于Con组（23±4.1%）与5% EtOH组大鼠（24±3.6%）。30%EtOH组（4.4±0.5次）进入开放臂次数也显著低于Con组大鼠（8.4±1.6次）；在SPT中，相比Con组30% EtOH组糖水消耗百分比下降了74%，相比5% EtOH组下降了66.7%。OFT中，30% EtOH组总运动距离（3160±114cm）相比Con组（3654±170cm）下降了13.5%，30% EtOH组中央区时间（25.57±4s）相比Con组（41±4.7s）缩短了37.6%；在MWMT空间学习1-3天30% EtOH组逃逸潜伏期均明显长于Con、5% EtOH组大鼠。综上说明，30% EtOH组大鼠血压自酒精暴露第2周开始显著上升并伴随有情感与认知障碍。
3. AH大鼠脑损伤及其蛋白组基础
3.1 脑神经血管单元差异蛋白的分类与功能富集 采用冷蔗糖缓冲液离心方法成功分离富集Con组与30% EtOH组脑NVU，通过蛋白质组学技术共鉴定出5574个蛋白质，4755个包含定量信息。30% EtOH组相比Con组（30%EtOH/Con），共有271个差异蛋白（133个上调，138个下调），其中207个蛋白节点形成了互作网络。对差异蛋白互作网络进行聚类分析，得到13个不同的聚类，包括缝隙连接（gap junction, GJ）、固有免疫应答（innate immune response）、细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）及少突胶质细胞分化（oligodendrocyte differentiation）等。
3.2 AH 大鼠的脑微血管损伤及蛋白组基础 FITC 灌注在荧光显微镜下进行成像，在30% EtOH组大鼠海马裂（hippocampal fissure,HF）、丘脑（thalamus,TH）、下丘脑（hypothalamus, HYP）与杏仁核（amygdala, AMY）微血管外的脑实质中，发现由渗漏的FITC产生的绿色荧光，AMY与HYP最为明显、TH部分血管外存在，而在大脑皮层、海马CA1、CA2、CA3及DG区未发现BBB损伤。Con组大鼠未观察到渗露入脑实质的FITC荧光。在NVU差异蛋白中，30% EtOH组缝隙连接蛋白Gjb1、Tuba4a、Tubb3、Tubb4a、Tubb6、Grb2、Gjc3与Tubb4b分别显著下调了18.5%、22.4%、22.4%、22%、28.8%、21.1%、20.9%与17.4%。与BBB形成相关的CLDN11、ITGB3、MBP 与 FBN1 分别下降了 18.6%、52.4%、22.5%与 17.2%，而 CTNND2 与 RAB13分别上调了 25.6%与 30.7%。进一步用 β-半乳糖苷酶染色标记衰老细胞，发现 30%EtOH 组大脑皮层与海马裂小血管内皮细胞存在染色阳性的衰老细胞，而皮层小血管周围的脑实质细胞无明显着色，提示30%EtOH作用下血管内皮细胞率先发生衰老。衰老信号相关蛋白中， CDKN1B、AGO1、MAP1LC3A、DNAJB1、NUP54、PSMB10与 PSME1 分别发生了 114.7%、26.5%、32.1%、23.2%、20.8%、24.7%、20.3%的上调，HIST2H2AC、THBS1与PRDX5分别发生了67.5%、61.5%与21.5%的下调。
此外，30% EtOH组大鼠脑内负性调控血压的STK39、ABAT与DDAH2分别下调了23.1%、24.7%与23.3%，而具有降血压效应的ENPEP 上调了25.3%。与Con及5% EtOH组大鼠相比，30% EtOH组大鼠脑小血管密度（分析区域内血管面积百分比）、总血管长度、分支指数（单位面积内血管分支点的数量）在前额叶皮层（prefrontal cortex,PFC）与尾壳核（caudate putamen, CPu）均明显增加。而各组大鼠海马、初级躯体感觉皮层（Primary somatosensory cortex, S1Cx）、胼胝体与内囊微血管密度血管密度无显著差异。海马组织WB检测发现：5% 与30%EtOH组MAG：PLP1比值（反映脑血管灌注水平）均显著下降。30% EtOH组脑内促血管生成因子与抑制血管生成因子水平发生变化。促血管生成因子STAB2、Grn、RAB13、LGALS1分别上调，抑制血管生成的THBS1、PF4、ITGB3、SIRT2与ARF6显著下调。同时，促血管生成的TGFA与LOXL2下调了35%与24.7%，抑制血管生成的BAIAP2、Prl、RNF213与LGALS9则上调了25.2%、26.2%、50.3%与22.7%。促血管生成与抗血管生成的差异蛋白总变化倍分别数为15.38倍与8.11倍。
miR-126在血管内皮细胞中特异性表达。与Con组相比，30% EtOH组大鼠海马miR-126的两个成熟体miR-126-5p与miR-126b的水平均显著上调。Targetscan软件预测受miR-126-5p与miR-126b调控的NVU差异蛋白分别有28个与19个发生下调。
3.3AH大鼠认知障碍的蛋白组基础30% EtOH组海马组织中Aβ40水平为17.3±1.3pg/mg组织，显著高于Con组大鼠（12.1±0.68pg/mg组织）。同时，30% EtOH组海马tau蛋白在苏氨酸205、231位点存在过度磷酸化。此外30% EtOH组海马存在神经元及突触相关蛋白丢失。
为更好的理解酒精性高血压认知障碍的发病机制，分析了 NVU 差异蛋白与 AD的相关性。199 个差异蛋白与 AD 具有显著相关性，其中 64 个与 β 淀粉样蛋白（β-Amyloid, Aβ）病理改变相关、40个与tau病理改变相关，30个差异蛋白与两者均相关。30个差异蛋白中与Aβ、tau病理改变正相关12个且显著上调，11个差异蛋白与Aβ、tau病理改变负相关且显著下调，这将促进NVU中Aβ聚集与tau病变。此外还有7个差异蛋白能够改善Aβ、tau病理改变。NVU中77个差异蛋白在AD动物模型中认知障碍与病理学改变之前出现差异表达，136个差异蛋白是AD的风险因素相关，两者重叠蛋白42个，这42个差异蛋白17个发生上调25个发生下调。以上结果说明这42个差异蛋白在30% EtOH组大鼠认知障碍中非常重要。此外，30% EtOH组大鼠脑中促轴突生长因子Kif5、Uchl1、PLP1与Tubb3分别下调了18.1%、17.3%、17.7%与22.4%。
3.4 AH大鼠脑内氧化应激与炎症反应增加的蛋白组基础 形态学研究显示，30%EtOH组相比Con组、5% EtOH组大鼠，海马星形胶质细胞在海马CA1与CA3区增加；小胶质细胞胞体面积增加、突起减少，提示这两种胶质细胞的活化。同时与氧化应激信号相关的差异蛋白，CDC37、PRDX5、HIST2H2AC、SIRT2与APOD分别发生了20.4%、21.%、67.5%、21.4%与23.6%的下调，AGO1发生了26.5%的上调。炎症反应相关的差异蛋白 Kng1、C4B、RNF213、NR3C1、TAP1 与 S100A9 相比 Con组分别上调了24%、30.3%、50.3%、21.2%、33.6%与37.7%。
4. MMP2在AH大鼠认知障碍中的关键作用
4.1 MMP2在AH大鼠中激活 WB检测各组海马匀浆MMP2与MMP9水平发现：MMP9活性在各组间无明显变化；30% EtOH相比Con组MMP2活性（激活型与前体的比值）上调了28.6%，30% EtOH相比5% EtOH组MMP2活性上调了26.7%。免疫荧光显示MMP2在海马主要表达于神经纤维且30% EtOH组大鼠海马MMP2表达增加。
HE染色与Masson染色也发现30% EtOH组大鼠肝脏出现明显的炎性浸润、脂滴与胶原沉积等。Con大鼠MMP2在不同器官表达丰度依次为肺＞肝＞心脏＞脑。与Con组相比，30% EtOH组肝脏MMP2上调了78.9%，5% EtOH组MMP2上调了79.8%；30% EtOH组血清MMP2激活水平调了34.2%。
4.2抑制MMP2改善AH大鼠认知障碍 慢性酒精暴露4周建立AH大鼠模型后使用SB-3CT抑制MMP2。SB-3CT治疗1周后第1天与第6天使用尾压法检测测各组大鼠血压，结果显示SB-3CT治疗结束后第1天与第6天30% EtOH+SB-3CT组SBP、DBP与MBP均可降低至与Con组相似的正常水平而30% EtOH+Veh依旧维持高血压状态。NORT记忆检测阶段Con组与30% EtOH+SB-3CT组大鼠对新物体表现出更多的兴趣，体现在检测阶段辨别指数（recognition index, RI）显著高于训练阶段RI，而30% EtOH+Veh组大鼠则不能区分新旧事物，即在检测阶段与训练阶段RI无显著差异。NORT中运动性轨也证明Con组与30% EtOH+SB-3CT组大鼠对新物体更感兴趣。表明抑制MMP2可有效降低30% EtOH+Veh组大鼠血压、改善其认知障碍。
4.3 抑制MMP2改善AH大鼠BBB损伤、降低炎症反应 SB-3CT干预可以显著抑制海马MMP2。FITC灌注脑血管后在30% EtOH+Veh组大鼠海马裂、及海马边缘中观察到微血管外脑实质存在大量渗漏的 FITC 绿色荧光，而 Con 组与 30%EtOH+SB-3CT大鼠在上述位置则没有发现FITC荧光渗露。30% EtOH+Veh组海马区FITC荧光强度相比Con组上调了69.9%，而SB-3CT治疗后30% EtOH+SB-3CT组相比30% EtOH+Veh组海马FITC荧光强度下降了44.9%与Con组水平相似。
血清ELISA显示30% EtOH+Veh组与Con组（IL-6: 22.7±1.0pg/ml; IL-1β：42.8±0.8pg/ml）相比促炎细胞因子 IL-6（28.4±2pg/ml）与 IL-1β（46.6±1.6pg/ml）分别上调了24.8%与8.9%。而SB-3CT处理1周后30% EtOH+SB-3CT组与30%EtOH+Veh组相比血清促炎细胞因子IL-6与IL-1β分别降低了16.4%与8%，此时30%EtOH+SB-3CT组IL-6与IL-1β水平与Con相似。与血清ELISA结果相似，海马中30% EtOH+Veh组IL-6（732.8±3.9pg/g/tissue）与IL-1β（723.4±4.1pg/g/tissue）水平相比Con组（IL-6: 676±18.8pg/g/tissue; IL-1β: 668.6±14.8pg/g/tissue）分别显著上调了8.4%与8.2%，而抑制MMP2可使IL-6与IL-1β水平下降至与Con组相似水平。此外，海马星形胶质细胞的活化也被SB-3CT抑制。
WB检测各组大鼠海马tau蛋白与突触相关蛋白，结果显示抑制MMP2可以降低30% EtOH+Veh组大鼠tau蛋白过度磷酸化、增加突触相关蛋白水平。
结论：本研究使用P鼠成功建立了AH大鼠模型，该模型伴有认知障碍及焦虑、抑郁等情绪异常。结合行为、形态、生化、NVU 蛋白组学等技术，研究 AH 大鼠脑损伤特点：如 BBB 损坏、内皮细胞衰老、突触丢失、炎症反应增加、Aβ 水平增加、tau蛋白过磷酸化等，为后续奠定了基础。MMP2 在 AH 大鼠中活性增加，抑制 MMP2显著改善AH大鼠的认知障碍，提示MMP2在AH大鼠脑损伤中具有重要作用。
酒精性高血压脑损伤的机制至今仍不清楚。脑神经血管单元（neurovascular unit, NVU）由血管细胞（内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞）、胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞与小胶质细胞）和神经元组成，对维持血脑屏障（blood-brain barrier， BBB）完整性与正常脑功能至关重要。目前，尚未见有关从NVU角度研究酒精性高血压脑损伤的报道。本论文不仅利用常规的行为、形态、生化等技术研究酒精性高血压脑损伤的特点，也利用了基于高分辨质谱的蛋白组学技术检测酒精性高血压大鼠NVU 的差异蛋白。而且数据分析过程中，在采用通用分析策略的同时，结合脑细胞类型蛋白质组学数据库、脑血管细胞类型数据库、血管生成因子与血管生成抑制因子PCR 芯片、STRING 数据库、VarElect 数据库、AlzData 数据库，以获得更为全面的酒精性高血压大鼠NVU的差异蛋白信息。
蛋白水解酶家族成员基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在血管重塑、细胞迁移和细胞外基质蛋白与粘附分子的加工过程中起重要作用。MMP2与高血压相关，高血压患者心脏及循环血液中 MMP2 显著上调。MMP2 活性增加可水解多种细胞外基质蛋白导致高血压内皮功能障碍，还可降解内皮型一氧化氮合酶或辅助因子造成血管内皮功能受损。抑制 MMP2 可以改善肾性高血压大鼠、胰岛素抵抗大鼠与妊娠导致的血压升高，改善其内皮功能紊乱。MMP2在酒精性高血压脑损伤中的作用尚不清楚。
目的：1.使用嗜酒精大鼠（alcohol-preferring rat，P鼠）建立酒精性高血压大鼠（alcoholic hypertensive rats, AH大鼠）模型，结合行为、形态、生化、蛋白组学等技术，研究AH大鼠脑损伤特点。2. 探究MMP2在AH大鼠认知障碍中的作用。
主要研究方法：
1. 实验动物及处理 65只3月龄P鼠按相似雌雄性别比例随机分为3组：蒸馏水灌胃组（Con组，n=18）、5%酒精（ethanol, EtOH）灌胃组（5% EtOH组，n=20）与30%酒精灌胃组（30% EtOH组，n=27）。30% EtOH组根据体重灌胃13ml/kg/day的30%EtOH，Con组与5% EtOH组分别灌胃等体积的蒸馏水或5%EtOH。
为研究抑制MMP2对AH大鼠的影响，3月龄P鼠（n=30）随机分为2组：Con组（n=8）与30% EtOH组（n=22,13ml/kg/day）。4周慢性酒精暴露并进行行为学检测后30% EtOH组大鼠随机分为2组（30% EtOH+Veh, n=8; 30% EtOH+SB-3CT, n=14）分别接受等体积的溶剂或SB-3CT（25mg/kg/day, MMP2/9选择性抑制剂）腹腔注射1周。
2. 血压测量及行为学检测
2.1 血压测量 采用非侵袭性血压测量方法尾压法（Tail-cuff 法）检测各组大鼠上午8:00-12:00am的收缩压（Systolic blood pressure, SBP）、舒张压（Diastolic blood pressure, DBP)与平均动脉压（Mean blood pressure, MBP）。
2.2认知相关检测使用水迷宫（Morris water maze test, MWMT）评价P鼠空间认知，学习阶段逃逸潜伏期反应空间学习能力，记忆检测阶段穿越平台次数反应了动物的空间记忆能力。在新事物识别实验（novel object recognition test, NORT）中使用辨别指数评价P鼠认知记忆。
2.3情绪相关检测使用旷场实验（Open field test, OFT）总运动距离与中央区时间分别评价P鼠自发活动与焦虑。使用高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）开放臂滞留时间百分比与进入次数评价P鼠焦虑。
抑郁使用OFT、糖水偏好实验（Sucrose preference test, SPT）、强迫游泳实验（Forced swimming test, FST）共同评价。SPT糖水消耗百分比下降反应快感缺失，FST中静止不动时间反应绝望。
3. NVU制备 使用冷蔗糖缓冲液离心方法分离富集P鼠脑NVU，并结合形态学进行鉴定，发现分离成分为结构完整的保留了与相邻细胞相互作用的 NVU。同时， NVU蛋白质组学结果中具备组成NVU细胞类型内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞与神经元特异性标志蛋白，这些结果表明成功分离富集了NVU。
4.蛋白质组学分析使用基于同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）技术的蛋白质组学技术检测并筛选NVU差异蛋白。差异蛋白阈值定义为：t-test统计学p＜0.05，30% EtOH组相比Con组变化倍数大于1.2倍为上调，小于0.83为下调。使用基因本论（Gene Ontology, GO）从细胞组成、分子功能、生物进程与 KEGG 通路进行通用分析。为全面深入挖掘酒精性高血压大鼠NVU的差异蛋白信息，使用脑细胞类型蛋白质组学数据库与脑血管细胞类型数据库分析差异蛋白表达细胞类型；STRING 数据库进行互作网络分析， Cytosacpe软件MCODE插件进行功能聚类及可视化；使用VarElect数据库批量查询差异蛋白功能；使用 VarElect 数据库及血管生成因子与血管生成抑制因子 PCR 芯片分析血管生成相关差异蛋白；使用AlzData数据库分析与老年痴呆（Alzheimers disease, AD）相关差异蛋白。
5.形态学检测使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyante,FITC）灌注脑血管评价BBB、β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老、HE染色（Hematoxylin and eosin stain）与Masson染色检测病理学改变。此外还使用免疫荧光（Immunofluorescence）检测了海马MMP2水平，使用免疫组织化学（Immunohistochemistry）检测了脑微血管密度、神经元数量、小胶质细胞与星形胶质细胞活化等。
6.免疫印迹（Western blotting, WB）与免疫酶联吸附反应（The sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）使用ELISA检测MMP2、氧化应激及促炎细胞因子水平，使用WB检测组织MMP2、MMP9、突触相关蛋白及tau蛋白等。
结果：
1.慢性酒精暴露建立AH大鼠模型慢性酒精暴露4周内30% EtOH组大鼠血液酒精浓度（blood ethanol concentration, BEC）均大于100mg/dl且前3周依次上升，至第3周达到峰值177.8±20mg/dl，而5% EtOH组4周内BEC均小于100mg/dl。
慢性酒精暴露造模前各组大鼠血压水平相似，30% EtOH组大鼠自第2周开始SBP、DBP与MBP显著上升（分别上升至149.7±3.5、121.2±3.4与130.3±3.4mmHg），并在造模第3、4周进一步上升。而5% EtOH组大鼠SBP、DBP、MBP与Con组相似，分别在120-123、90-101、99-109mmHg内波动。停止酒精灌胃处理后第11天30%EtOH组大鼠（AH大鼠）SBP、DBP与MBP相比Con与5% EtOH组依旧显著上升，说明30%EtOH暴露诱导的酒精性高血压可持续维持。
2.AH大鼠出现情感与认知障碍在EPM中30% EtOH组大鼠在开放臂滞留时间百分比为13±1.5%，明显低于Con组（23±4.1%）与5% EtOH组大鼠（24±3.6%）。30%EtOH组（4.4±0.5次）进入开放臂次数也显著低于Con组大鼠（8.4±1.6次）；在SPT中，相比Con组30% EtOH组糖水消耗百分比下降了74%，相比5% EtOH组下降了66.7%。OFT中，30% EtOH组总运动距离（3160±114cm）相比Con组（3654±170cm）下降了13.5%，30% EtOH组中央区时间（25.57±4s）相比Con组（41±4.7s）缩短了37.6%；在MWMT空间学习1-3天30% EtOH组逃逸潜伏期均明显长于Con、5% EtOH组大鼠。综上说明，30% EtOH组大鼠血压自酒精暴露第2周开始显著上升并伴随有情感与认知障碍。
3. AH大鼠脑损伤及其蛋白组基础
3.1 脑神经血管单元差异蛋白的分类与功能富集 采用冷蔗糖缓冲液离心方法成功分离富集Con组与30% EtOH组脑NVU，通过蛋白质组学技术共鉴定出5574个蛋白质，4755个包含定量信息。30% EtOH组相比Con组（30%EtOH/Con），共有271个差异蛋白（133个上调，138个下调），其中207个蛋白节点形成了互作网络。对差异蛋白互作网络进行聚类分析，得到13个不同的聚类，包括缝隙连接（gap junction, GJ）、固有免疫应答（innate immune response）、细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）及少突胶质细胞分化（oligodendrocyte differentiation）等。
3.2 AH 大鼠的脑微血管损伤及蛋白组基础 FITC 灌注在荧光显微镜下进行成像，在30% EtOH组大鼠海马裂（hippocampal fissure,HF）、丘脑（thalamus,TH）、下丘脑（hypothalamus, HYP）与杏仁核（amygdala, AMY）微血管外的脑实质中，发现由渗漏的FITC产生的绿色荧光，AMY与HYP最为明显、TH部分血管外存在，而在大脑皮层、海马CA1、CA2、CA3及DG区未发现BBB损伤。Con组大鼠未观察到渗露入脑实质的FITC荧光。在NVU差异蛋白中，30% EtOH组缝隙连接蛋白Gjb1、Tuba4a、Tubb3、Tubb4a、Tubb6、Grb2、Gjc3与Tubb4b分别显著下调了18.5%、22.4%、22.4%、22%、28.8%、21.1%、20.9%与17.4%。与BBB形成相关的CLDN11、ITGB3、MBP 与 FBN1 分别下降了 18.6%、52.4%、22.5%与 17.2%，而 CTNND2 与 RAB13分别上调了 25.6%与 30.7%。进一步用 β-半乳糖苷酶染色标记衰老细胞，发现 30%EtOH 组大脑皮层与海马裂小血管内皮细胞存在染色阳性的衰老细胞，而皮层小血管周围的脑实质细胞无明显着色，提示30%EtOH作用下血管内皮细胞率先发生衰老。衰老信号相关蛋白中， CDKN1B、AGO1、MAP1LC3A、DNAJB1、NUP54、PSMB10与 PSME1 分别发生了 114.7%、26.5%、32.1%、23.2%、20.8%、24.7%、20.3%的上调，HIST2H2AC、THBS1与PRDX5分别发生了67.5%、61.5%与21.5%的下调。
此外，30% EtOH组大鼠脑内负性调控血压的STK39、ABAT与DDAH2分别下调了23.1%、24.7%与23.3%，而具有降血压效应的ENPEP 上调了25.3%。与Con及5% EtOH组大鼠相比，30% EtOH组大鼠脑小血管密度（分析区域内血管面积百分比）、总血管长度、分支指数（单位面积内血管分支点的数量）在前额叶皮层（prefrontal cortex,PFC）与尾壳核（caudate putamen, CPu）均明显增加。而各组大鼠海马、初级躯体感觉皮层（Primary somatosensory cortex, S1Cx）、胼胝体与内囊微血管密度血管密度无显著差异。海马组织WB检测发现：5% 与30%EtOH组MAG：PLP1比值（反映脑血管灌注水平）均显著下降。30% EtOH组脑内促血管生成因子与抑制血管生成因子水平发生变化。促血管生成因子STAB2、Grn、RAB13、LGALS1分别上调，抑制血管生成的THBS1、PF4、ITGB3、SIRT2与ARF6显著下调。同时，促血管生成的TGFA与LOXL2下调了35%与24.7%，抑制血管生成的BAIAP2、Prl、RNF213与LGALS9则上调了25.2%、26.2%、50.3%与22.7%。促血管生成与抗血管生成的差异蛋白总变化倍分别数为15.38倍与8.11倍。
miR-126在血管内皮细胞中特异性表达。与Con组相比，30% EtOH组大鼠海马miR-126的两个成熟体miR-126-5p与miR-126b的水平均显著上调。Targetscan软件预测受miR-126-5p与miR-126b调控的NVU差异蛋白分别有28个与19个发生下调。
3.3AH大鼠认知障碍的蛋白组基础30% EtOH组海马组织中Aβ40水平为17.3±1.3pg/mg组织，显著高于Con组大鼠（12.1±0.68pg/mg组织）。同时，30% EtOH组海马tau蛋白在苏氨酸205、231位点存在过度磷酸化。此外30% EtOH组海马存在神经元及突触相关蛋白丢失。
为更好的理解酒精性高血压认知障碍的发病机制，分析了 NVU 差异蛋白与 AD的相关性。199 个差异蛋白与 AD 具有显著相关性，其中 64 个与 β 淀粉样蛋白（β-Amyloid, Aβ）病理改变相关、40个与tau病理改变相关，30个差异蛋白与两者均相关。30个差异蛋白中与Aβ、tau病理改变正相关12个且显著上调，11个差异蛋白与Aβ、tau病理改变负相关且显著下调，这将促进NVU中Aβ聚集与tau病变。此外还有7个差异蛋白能够改善Aβ、tau病理改变。NVU中77个差异蛋白在AD动物模型中认知障碍与病理学改变之前出现差异表达，136个差异蛋白是AD的风险因素相关，两者重叠蛋白42个，这42个差异蛋白17个发生上调25个发生下调。以上结果说明这42个差异蛋白在30% EtOH组大鼠认知障碍中非常重要。此外，30% EtOH组大鼠脑中促轴突生长因子Kif5、Uchl1、PLP1与Tubb3分别下调了18.1%、17.3%、17.7%与22.4%。
3.4 AH大鼠脑内氧化应激与炎症反应增加的蛋白组基础 形态学研究显示，30%EtOH组相比Con组、5% EtOH组大鼠，海马星形胶质细胞在海马CA1与CA3区增加；小胶质细胞胞体面积增加、突起减少，提示这两种胶质细胞的活化。同时与氧化应激信号相关的差异蛋白，CDC37、PRDX5、HIST2H2AC、SIRT2与APOD分别发生了20.4%、21.%、67.5%、21.4%与23.6%的下调，AGO1发生了26.5%的上调。炎症反应相关的差异蛋白 Kng1、C4B、RNF213、NR3C1、TAP1 与 S100A9 相比 Con组分别上调了24%、30.3%、50.3%、21.2%、33.6%与37.7%。
4. MMP2在AH大鼠认知障碍中的关键作用
4.1 MMP2在AH大鼠中激活 WB检测各组海马匀浆MMP2与MMP9水平发现：MMP9活性在各组间无明显变化；30% EtOH相比Con组MMP2活性（激活型与前体的比值）上调了28.6%，30% EtOH相比5% EtOH组MMP2活性上调了26.7%。免疫荧光显示MMP2在海马主要表达于神经纤维且30% EtOH组大鼠海马MMP2表达增加。
HE染色与Masson染色也发现30% EtOH组大鼠肝脏出现明显的炎性浸润、脂滴与胶原沉积等。Con大鼠MMP2在不同器官表达丰度依次为肺＞肝＞心脏＞脑。与Con组相比，30% EtOH组肝脏MMP2上调了78.9%，5% EtOH组MMP2上调了79.8%；30% EtOH组血清MMP2激活水平调了34.2%。
4.2抑制MMP2改善AH大鼠认知障碍 慢性酒精暴露4周建立AH大鼠模型后使用SB-3CT抑制MMP2。SB-3CT治疗1周后第1天与第6天使用尾压法检测测各组大鼠血压，结果显示SB-3CT治疗结束后第1天与第6天30% EtOH+SB-3CT组SBP、DBP与MBP均可降低至与Con组相似的正常水平而30% EtOH+Veh依旧维持高血压状态。NORT记忆检测阶段Con组与30% EtOH+SB-3CT组大鼠对新物体表现出更多的兴趣，体现在检测阶段辨别指数（recognition index, RI）显著高于训练阶段RI，而30% EtOH+Veh组大鼠则不能区分新旧事物，即在检测阶段与训练阶段RI无显著差异。NORT中运动性轨也证明Con组与30% EtOH+SB-3CT组大鼠对新物体更感兴趣。表明抑制MMP2可有效降低30% EtOH+Veh组大鼠血压、改善其认知障碍。
4.3 抑制MMP2改善AH大鼠BBB损伤、降低炎症反应 SB-3CT干预可以显著抑制海马MMP2。FITC灌注脑血管后在30% EtOH+Veh组大鼠海马裂、及海马边缘中观察到微血管外脑实质存在大量渗漏的 FITC 绿色荧光，而 Con 组与 30%EtOH+SB-3CT大鼠在上述位置则没有发现FITC荧光渗露。30% EtOH+Veh组海马区FITC荧光强度相比Con组上调了69.9%，而SB-3CT治疗后30% EtOH+SB-3CT组相比30% EtOH+Veh组海马FITC荧光强度下降了44.9%与Con组水平相似。
血清ELISA显示30% EtOH+Veh组与Con组（IL-6: 22.7±1.0pg/ml; IL-1β：42.8±0.8pg/ml）相比促炎细胞因子 IL-6（28.4±2pg/ml）与 IL-1β（46.6±1.6pg/ml）分别上调了24.8%与8.9%。而SB-3CT处理1周后30% EtOH+SB-3CT组与30%EtOH+Veh组相比血清促炎细胞因子IL-6与IL-1β分别降低了16.4%与8%，此时30%EtOH+SB-3CT组IL-6与IL-1β水平与Con相似。与血清ELISA结果相似，海马中30% EtOH+Veh组IL-6（732.8±3.9pg/g/tissue）与IL-1β（723.4±4.1pg/g/tissue）水平相比Con组（IL-6: 676±18.8pg/g/tissue; IL-1β: 668.6±14.8pg/g/tissue）分别显著上调了8.4%与8.2%，而抑制MMP2可使IL-6与IL-1β水平下降至与Con组相似水平。此外，海马星形胶质细胞的活化也被SB-3CT抑制。
WB检测各组大鼠海马tau蛋白与突触相关蛋白，结果显示抑制MMP2可以降低30% EtOH+Veh组大鼠tau蛋白过度磷酸化、增加突触相关蛋白水平。
结论：本研究使用P鼠成功建立了AH大鼠模型，该模型伴有认知障碍及焦虑、抑郁等情绪异常。结合行为、形态、生化、NVU 蛋白组学等技术，研究 AH 大鼠脑损伤特点：如 BBB 损坏、内皮细胞衰老、突触丢失、炎症反应增加、Aβ 水平增加、tau蛋白过磷酸化等，为后续奠定了基础。MMP2 在 AH 大鼠中活性增加，抑制 MMP2显著改善AH大鼠的认知障碍，提示MMP2在AH大鼠脑损伤中具有重要作用。