论文部分内容阅读
核仁是间期细胞核中最显著的结构,是核糖体RNA基因转录和转录产物进一步加工成熟的场所。核仁三个主要特征区域由纤维中心(fibrillar center,FC)结构区域和致密纤维组分结构区域(dense fibrillar component,DFC)以及颗粒区结构区域(granular component,GC)组成。在细胞周期进程中核仁发生规律的解体、消失和重建的过程,这种高度动态变化的特点使核仁超微结构及其功能的研究进展缓慢,也是存在诸多争论分歧的重要原因之一。争论的主要焦点是核仁中核糖体基因(r DNA)分布以及转录位点、转录后形成r RNA前体的剪切位点等在哪个具体的区域?过去的大多数研究者只是针对细胞周期中某个时期的细胞核仁进行相关的研究,却忽视了核仁细胞分裂间期也是一个相对的动态结果,核仁内部结构组分及其物质是跟随着G1期、S期、G2期进程而发生变化,因此r DNA分布、转录和剪切位点也应是动态变化的。本文采用胸腺嘧啶核苷双阻断法对HeLa细胞进行同步化培养,PCNA免疫抗体标记、吖啶橙特异性染色法以及常规电子显微镜超薄切片技术结合NAMA-Ur特异性方法、Bernhard染色法等对HeLa细胞核仁在细胞周期不同时段的超微结构变化以及核仁中r DNA分布和转录位点进行研究,主要结果如下:1.HeLa细胞核仁FC和DFC在细胞周期进程中不同时段的动态变化:在早G1期的小核仁中FC和DFC的体积都较小,界限模糊,到晚G1期时段核仁体积变大,形成较大FC和DFC。早S期FC和DFC经典构型发生改变,中S期FC和DFC结构消失,核仁内呈现匀质结构,晚S期时,较小的FC结构重新出现,数量较多。G2期,大型FC和DFC与数量众多的小FC和DFC并存于核仁中。2.通过NAMA-Ur方法对r DNA进行特异性染色,结果显示r DNA组分在细胞周期进程中分布位置和形态随着不同时期而改变:早G1期以染色质纤维的形式分布在FC内部或边缘;晚G1期、早S期、晚S期和G2期的FC区域分布致密的染色质块和DFC区域周围松散的DNA纤维组分;中S期DNA组分两种形态分布:一种是FC区域染色较浅的团块状DNA组分,一种是在匀质结构中的致密的颗粒状DNA组分。可见DNA组分分布范围随着细胞周期进程的不同时段而改变。3.通过Bernhard染色对核仁RNA进行优先染色,结果显示HeLa细胞核仁r RNA转录位点标记出现在FC和DFC交界处以及DFC区域,在细胞间期不同时段的核仁中,结果也不尽相同:在G1期,核仁FC边缘少量染色较浅的RNA组分。在早S期,FC区域边缘有较少的RNA组分。在中S期,匀质结构内的RNA组分呈致密的纤维条索状相互连接。晚S期,FC边缘含有致密的RNA颗粒组分。在G2期,主要在DFC区域及其与FC交界有致密的“半月形”RNA组分结构,说明此时转录生成r RNA初始产物的速度最高,活跃度最强。4.采用吖啶橙特异性染色HeLa细胞核仁DNA和RNA,结果显示早G1期,较强的DNA绿色荧光分布核膜处,RNA橙色荧光主要分布在细胞质。晚G1期和S期,DNA绿色荧光主要分布核仁及其核仁周边,RNA橙色荧光主要分布在核仁。在G2期,RNA橙色荧光信号最强,说明在G2期RNA转录活跃程度最强。5.采用B23蛋白免疫抗体标记在光镜下观察细胞周期不同时段的荧光信号强度变化,观察结果提示,在G1期、S期和G2期时段B23蛋白一直存在,特别是在G2期B23蛋白标记荧光信号最强,在分裂期细胞核仁内几乎观察不到明显的B23蛋白荧光信号,说明在核仁中存在着活跃状态和储存状态两种不同形式。综上所述,在HeLa细胞核仁结构中FC和DFC数目和形态在细胞分裂间期过程中同样是高度动态变化的,特别是在中S期时段核仁FC和DFC发生了改组与重构的形态学变化,这是我们的新发现。在细胞间期中核仁FC和DFC区域的r DNA组分也是动态变化的。提示核仁r RNA转录、前体剪切的活动状态和位点随着细胞间期的G1、S、G2期进程而不断变化。本实验观察结果为进一步阐明真核生物细胞核仁在细胞周期进程中超微结构与r RNA转录、剪切之间的关系提供和完善了更多的实验依据和数据基础。