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研究背景前列腺癌作为常见的恶性肿瘤,在世界范围内严重影响着男性健康。由于早期前列腺癌缺乏明显的症状和体征,绝大多数就诊患者在就诊时已经到了癌症晚期并发生远处转移,失去了最佳的治疗时机。因此,深入了解前列腺癌发生发展的分子生物学机制,对前列腺癌临床的早期发现和治疗显的尤为迫切。肿瘤微环境（tumor microenviroment,TME）是肿瘤所处的一种由多种细胞、基质组成的独特生长环境,其中主要的细胞组成成分是一种具有有平滑肌细胞和正常成纤维细胞双重特性的、被活化的成纤维细胞,也被称为癌相关成纤维细胞（Carcinoma associated fibroblasts,CAFs）。CAFs能够通过分泌各种因子及参与信号转导,影响肿瘤细胞的生长、增殖、转移及浸润等。已有文献证实,miR-17-92基因簇作为癌基因能够显著促进前列腺癌细胞的生长、增殖、迁移及侵袭能力。但是该基因在前列腺癌肿瘤微环境中发挥的作用鲜有报道。因此,在肿瘤微环境中深入研究miR-17-92基因簇对肿瘤细胞及成纤维细胞的作用,或可为前列腺癌的治疗提供新的方向。研究目的本研究试图阐明在miR-17-92基因簇在前列腺癌肿瘤微环境中,对肿瘤细胞和成纤维细胞的生物学行为的产生的影响,并探讨其可能的潜在作用机制。第一部分miR-17-92基因簇对前列腺癌肿瘤微环境中成纤维细胞生物学行为的影响及作用机制方法建立具有G418抗性的正常前列腺成纤维细胞株WPMY-1,便于后续共培养研究。建立非接触式细胞共培养模型,收集对照组前列腺癌细胞DU145-contorl和实验组mir-17-92基因簇高表达前列腺癌细胞DU145-miR-17-92的条件培养基,并对WPMY-1培养48h。同时,建立接触式细胞共培养模型,将DU145-control和DU145-miR-17-92细胞分别与WPMY-1细胞混合培养48h,并通过G418药物筛选作用,去除前列腺癌细胞。通过x CELLigence系统实时动态观察经过处理后的WPMY-1细胞的生长、迁移以及侵袭能力的变化。采用CCK8法检测经过处理后的WPMY-1细胞增殖的变化。应用流式细胞术检测WPMY-1细胞凋亡的变化。应用免疫组化法检测WPMY-1细胞中成纤维细胞及癌相关成纤维细胞的细胞标志物表达。应用ELISA法检测WPMY-1细胞分泌细胞因子的变化。通过Western blot技术检测处理后的WPMY-1细胞相关信号通路蛋白水平的表达。结果成功建立具有G418抗性的正常前列腺成纤维细胞WPMY-1。在非接触式共培养体系中,前列腺癌细胞DU145-miR-17-92的条件培养基对正常成纤维WPMY-1细胞的生长、增殖产生了明显的促进作用,对细胞凋亡产生了明显的抑制作用。同时,在DU145-miR-17-92细胞条件培养基的影响下,成纤维细胞获得了显著的迁移和侵袭能力。IHC检测发现WPMY-1细胞在DU145-miR-17-92细胞条件培养基作用下出现癌相关成纤维细胞标志物Desmin和FAP高表达。在蛋白表达水平方面出现AKT信号通路和ERK信号通路的活化,Desmin,HGF,ITGB1、Kreatin8/18蛋白上调。ELISA结果显示,TGF-β1和CXCL-12/SDF-1在DU145-miR-17-92细胞条件培养基作用组中的表达显著高于DU145-control细胞条件培养基作用组,CXCL-8/IL-8和CXCL-13/BCL/BCA-1则相反。在接触式共培养体系中,与DU145-control细胞进行培养后的成纤维细胞WPMY-1出现了大量死亡,而与DU145-miR-17-92细胞进行共培养的WPMY-1能够存活。实验显示,虽然与DU145-miR-17-92共培养后的WPMY-1细胞在生长与增殖方面发生明显抑制,但其细胞凋亡率表现为降低。共培养后WPMY-1细胞并未获得迁移能力,对侵袭能力无显著影响。在蛋白表达水平方面,与DU145-miR-17-92细胞进行共培养的WPMY-1细胞的p-AKT-473表现为一定程度的上调,但ERK1/2蛋白表现为下调。PTEN、Cyclin D1蛋白表达则出现一定程度下调。Desmin、Bcl-xl与ITGB1表达升高。TGF-β1、CXCL-8/IL-8、CXCL-12/SDF-1和CXCL-13/BCL/BCA-1四种因子的分泌,在共培养后的WPMY-1细胞中都出现了显著上调。第二部分mir-17-92基因簇在前列腺癌肿瘤微环境成纤维细胞和前列腺癌细胞相互调控中的作用及机制探讨方法建立非接触式细胞共培养模型,收集前列腺正常成纤维细胞WPMY-1的条件培养基,分别作用于前列腺癌DU145-contorl细胞和DU145-miR-17-92细胞,培养48h。同时,建立接触式细胞共培养模型,将WPMY-1细胞分别与DU145-control和DU145-miR-17-92细胞混合培养48h,并通过嘌呤霉素的药物筛选作用,去除前列腺成纤维细胞。通过x CELLigence系统实时动态观察经过处理后的DU145-control和DU145-miR-17-92细胞的生长、迁移以及侵袭能力的变化。采用CCK8法检测处理后的两组前列腺癌细胞在细胞增殖方面的变化。应用流式细胞术检测处理后的前列腺癌细胞凋亡的变化。应用ELISA法检测细胞分泌细胞因子的变化。通过Western blot技术检测处理后的两组肿瘤细胞的相关信号通路蛋白水平的表达。结果在非接触式共培养体系中,WPMY-1条件培养基对前列腺癌细胞DU145-miR-17-92细胞及其对照组DU145-control细胞的生长和增殖产生了明显的抑制作用,对细胞凋亡则产生了一定的促进作用。同时,两种肿瘤细胞的迁移能力出现了一定程度的增强,但是在侵袭能力方面没有明显变化。在蛋白表达方面,DU145-miR-17-92细胞PTEN和Cyclin D1的蛋白表达有一定程度的上调,抗凋亡蛋白Bcl-2在两组肿瘤细胞中均有表达的降低,Bcl-xl仅在DU145-control细胞中出现低表达。ERK信号通路中p-ERK1/2蛋白表达水平降低。迁移与侵袭相关蛋白ITGB1、Kreatin8/18和MMP9在DU145-miR-17-92细胞组中表达的上调程度明显高于DU145-control细胞组。两组肿瘤细胞的相关细胞分泌因子TGF-β1、CXCL-8/IL-8、CXCL-12/SDF-1和CXCL-13/BCL/BCA-1,在成纤维胞条件培养基的影响下分泌量均显著降低。在接触式共培养体系中,与WPMY-1细胞共培养后的两组前列腺癌细胞在细胞增殖、迁移和侵袭能力方面无明显变化。细胞生长在48h前的DU145-control细胞中出现了明显的抑制作用,在32h前的DU145-miR-17-92细胞中则出现了明显的促进作用,但以上差异均随时间进展逐渐消失。细胞凋亡率在DU145-control细胞中出现了明显的升高,同时伴随有抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。但在DU145-miR-17-92细胞中则出现了显著的降低。在蛋白表达水平方面,DU145-miR-17-92细胞中p-ERK1/2蛋白的表达出现了明显的下调,p-AKT-437及ITGB1则是上调。其蛋白则无明显变化。两组细胞在TGF-β1和CXCL-8/IL-8的分泌中均出现上调,CXCL-12/SDF-1分泌上调仅出现在共培养后的DU145-miR-17-92细胞中,CXCL-13/BCL/BCA-1的分泌在两组细胞中均无显著变化。第三部分mir-17-92基因簇对前列腺癌细胞外泌体蛋白的影响方法对前列腺肿瘤细胞的外泌体蛋白进行提取,使用免疫蛋白印迹法检测外泌体标志性蛋白表达。使用蛋白质色谱质谱法进行外泌体蛋白质组学鉴定并比较外泌体蛋白数据库相应蛋白表达。对差异性蛋白进行热图分析、韦恩图分析、GO分析、代谢通路和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。应用q-RT-PCR方法检测外泌体中miR-17-92基因簇表达情况。对外泌体进行染色并行进行细胞內吞实验。结果外泌体蛋白免疫印迹实验显示,所提取蛋白成功表达外泌体特异性蛋白Flotillin。蛋白质谱技术检测结果显示,所提取肿瘤细胞外泌体中所提取的1677个蛋白中,有1407个蛋白被外泌体数据库Exocarta收录,命中率为83.90%。蛋白组学分析结果显示,DU145-miR-17-92细胞组与DU145-control细胞组间具有大量显著的差异性表达蛋白,且差异性蛋白主要来源于外泌体、溶酶体等成分,主要参与了蛋白质代谢,转运,细胞代谢,细胞生长及能量代谢等过程。差异性蛋白质的功能主要集中在催化活性,转运活性,连接酶活性,热休克蛋白活性,转录调节活性等方面。KEGG富集结果显示,差异性蛋白在碳代谢和内质网蛋白质进程通路的富集程度很高,其次为紧密连接、吞噬体途径、蛋白酶体途径等。q RT-PCR检测结果显示,DU145-miR-17-92细胞外泌体中,miR-17-92基因簇各家族成员均有明显高表达。外泌体与细胞共培养结果显示,肿瘤细胞分泌外泌体可以被正常成纤维细胞成功摄取。结论1.miR-17-92基因簇可以通过细胞间非接触方式显著活化正常成纤维细胞AKT和ERK信号通路,促进成纤维细胞的生长、增殖,抑制凋亡,并赋予其细胞迁移的能力。同时,miR-17-92基因簇可以显著促进成纤维细胞向CAFs的转化。miR-17-92基因簇可以通过细胞接触的方式维持成纤维细胞的存活状态,显著抑制成纤维细胞凋亡,并在一定程度上促进向CAFs的转化。2.前列腺正常成纤维细胞可以通过细胞外分泌的方式抑制肿瘤细胞内AKT信号通路的活性,抑制前列腺癌细胞生长、增殖,促进其凋亡,同时增强肿瘤细胞的迁移能力,降低其生物活性因子的分泌功能。成纤维细胞也可以通过细胞间接触方式,活化miR-17-92基因簇高表达肿瘤细胞的ERK通路,抑制其凋亡,并促进肿瘤细胞分泌生物活性因子。3.miR-17-92基因簇高表达细胞的外泌体中含有丰富细胞活性物质,并且高表达miR-17-92基因。肿瘤细胞外泌体很可能通过细胞內吞的方式转运miR-17-92基因簇,并对正常成纤维细胞产生作用。