猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种B类病毒性传染疾病,该病毒在临床上主要造成妊娠母猪的流产、死胎以及引起仔猪呼吸障碍,还会引起猪群的免疫抑制和持续性感染等免疫学特性。PRRSV是一种单股正链RNA病毒,易变异,具有抗体依赖性增强作用(ADE)。研究PRRSV的ADE作用机制对PRRS的防治和新型疫苗的研制具有重要意义。PRRSV具有严格的细胞嗜性,在体内外均能够入侵感染单核-巨噬细胞,而受体是介导病毒入侵宿主的决定因素。目前人们对PRRSV感染PAM过程的认识是：首先HS将PRRSV粒子吸附到细胞表面,引起Sn N端唾液酸结合位点与病毒的GP5/M复合体结合,激活Sn信号通道诱发细胞的内吞作用,之后在CD163分子的作用下将PRRSV基因组mRNA释放到细胞浆中,继而完成细胞的复制过程。还有研究表明CD163分子的SRCR5的结构域可以与病毒粒子的GP2和GP4蛋白发生相互作用。然而目前对于CD163分子在PRRSV入侵宿主细胞的过程中的作用机制还不是十分清楚,而且对其在PRRSV-ADE过程中的是否发挥作用的研究还未见报道。因此本试验分4个片段克隆并原核表达CD163分子胞外区结构域,免疫小鼠得阳性血清,制备并纯化其相应的特异性多克隆抗体,通过研究这些抗体是否能够阻断PRRSV和免疫复合物的感染来鉴定CD163分子在PRRSV入侵过程中的作用,以及探索其在PRRSV-ADE中的作用。清道夫受体CD163蛋白大小是130KDa,故被称为M130蛋白,是Ⅰ型糖基化蛋白,富含半胱氨酸。经软件预测分析猪PAM的CD163发现其包括胞外区、跨膜区和胞质尾区,且胞外区含有一个信号肽(1-40AA)和9个富含半胱氨酸(SRCR)结构域,且1-9个SRCR结构域在CD163中的位置分别是54AA-151AA,161AA-258AA,268AA-365AA,375AA-472AA,480AA-577AA,585AA-682AA,721AA-818AA,828AA-925AA,931AA-1028AA。本试验将CD163分子分四个片段进行克隆和原核表达,即CD163-P1(SRCR1-2), CD163-P2(SRCR3-4), CD163-P3(SRCR5-6)和CD163-P4(SRCR7-9)。用四种重组蛋白分别免疫小鼠制备多克隆抗体血清,经硫酸铵盐析法和DE-52离子交换层析技术二步法提取并纯化得到四种纯度较高的特异性抗体。用PBS灌洗法将猪肺泡原代巨噬细胞洗出并铺板,之后加入四种纯化后的抗CD163抗体和混合抗体孵育1h封闭PAM细胞,再分别用Hn-1/06PRRSV4倍稀释的PRRSV-IgG免疫复合物处理细胞24h和48h,并设置阴性对照和空白对照组。用已建立的PRRSV SYBR Green I实时定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的mRNA水平再用GraphPad Prism5软件进行处理所得到的数据。试验一首先从健康仔猪肺泡中收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),提取细胞总RNA,参照GenBank:EU016226.1四个不同片段设计四对特异性引物,再用RT-PCR方法扩增出四个CD163基因片段,长度分别为698bp、721bp、609bp和988bp,并将这些基因片段亚克隆到质粒载体PET-32a中,构建重组表达质粒PET-CD163-P1,PET-CD163-P2,PET-CD163-P3和PET-CD163-P4。将重组质粒转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导得到成功表达,表达蛋白大小分别约为44.2kDa、45kDa、41.4kDa和52.0kDa,与预测的融合蛋白大小一致。通过优化IPTG诱导表达的最佳时间和最适浓度,大量表达重组蛋白CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,并用尿素法洗涤纯化重组蛋白。用四种纯化重组蛋白1分别免疫小鼠,制备抗四种重组蛋白的多克隆抗体,经间接ELISA方法检测阳性抗体血清效价分别为1：10240,1：12800,1：25600和1：12800。采用硫酸铵盐析法粗提抗体IgG,再经DE-52纤维素离子交换层析技术方法纯化粗提IgG,用紫外分光光度计测定蛋白浓度。试验二用试验一所制备的四种抗体,以及四种抗体的混合物分别封闭PAM细胞1h,经PRRSV感染24h和48h,同时设置阴性对照和空白对照组,用已建立的绝对荧光定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的mRNA水平,用GraphPad Prism5软件进行处理所得到的数据。由试验结果看出,PRRSV感染24h和48h时,鼠抗猪CD163-P1,CD163-P2和CD163-P4抗体封闭组病毒mRNA复制水平与相应的鼠阴性IgG对照组比较差异不明显,而鼠抗猪CD163-P3抗体封闭组和混合抗体CD163-H封闭组的PRRSV mRNA拷贝数均显著低于鼠阴性IgG组,并且鼠抗猪CD163-P3抗体封闭组在24h时间段的PRRSV mRNA水平是鼠阴性IgG对照组的0.78倍(P<0.01),在48h时是对照组的0.85倍(P<0.05)。表明此方法所制备的鼠抗猪CD163-P3抗体能够阻碍PRRSV感染PAM细胞,并暗示CD163-P3(SRCR5-6)可能参与PRRSV感染PAM细胞过程,其他片段不影响PRRSV的感染宿主过程,这与人们所认为的CD163分子的主要功能结构域可能是SRCR5相一致。同时这些还表明用本试验方法所制备、提取和纯化的抗体具有生物学活性,为进一步研究PRRSV感染机制及PRRSV-ADE作用机制提供参考。试验三用试验—所制备的抗体,以及四种抗体的混合物分别封闭PAM细胞,再以4倍稀释的免疫复合物(PRRSV-IgG)处理24h和48h,同时设立阴性对照和空白对照组以及纯病毒组,用已建立的绝对荧光定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的mRNA含量,用GraphPad Prism5软件进行处理所得到的数据。结果显示,在免疫复合物处理24h和48h时,鼠抗猪CD163-P1和CD163-P2抗体封闭组的PRRSV mRNA拷贝数与相应的鼠阴性1gG对照组比较均差别不大；鼠抗猪CD163-P3抗体组的PRRSV增殖水平均却显著低于对照组,且鼠抗猪CD163-P3抗体封闭组在24h时间段的PRRSV mRNA水平是鼠阴性IgG对照组的0.87倍,在48h时是对照组的0.75倍(P<0.01)；鼠抗猪CD163-P4抗体组的PRRSV mRNA拷贝数均低于鼠阴性IgG对照组,但差异不显著；而鼠抗猪CD163-H抗体组PRRSV mRNA拷贝数均显著低于鼠阴性IgG对照组,在24h时间段的PRRSV mRNA水平是鼠阴性IgG对照组的0.88倍(P<0.05),在48h时是对照组的0.83倍(P<0.05),表明鼠抗猪CD163-P3抗体能够影响PRRSV-IgG在细胞内的复制增殖,暗示受体CD163-P3可能参与免疫复合物在细胞内的增殖。我们推测免疫复合物侵入宿主细胞后通过PRRSV的GP2a和GP4蛋白与CD163分子相互作用,改变PRRSV的结构,促使mRNA释放到细胞浆中,继而完成PRRSV的复制增殖,而且发挥主要功能作用的部分是CD163-P3(SRCR5-6),而CD163-P4(SRCR7-9)也可能发挥一定的作用。本研究初步研究探讨了CD163受体胞外域在PRRSV-ADE中的作用,为研究病毒ADE作用机制、为有效疫苗的研制提供了参考依据,且对病毒性疾病的防治具有重要的意义。