目的: 动物实验和临床试验证实了基因治疗在缺血性心脏病中的治疗作用,但基因治疗的现状仍停留于由动物实验向临床应用的过渡阶段,影响临床推广应用的主要原因在于基因治疗在载体的安全性、基因治疗的方法以及基因转染的调控和靶向性等方面还不完善,成为目前基因治疗研究中亟待突破的关键。其中基因治疗的靶向性决定了基因治疗的临床应用价值。 缺血心肌基因治疗的目的是在心肌缺血区产生新生血管,以达到“分子架桥术”的目的。然而促血管生长因子基因在非靶组织、细胞中表达时可能导致一定的毒性和风险。基因治疗的非靶向性一方面使缺血心肌的基因治疗只能通过局部给药的方式进行,以尽可能避免基因的非靶向性表达;另一方面局部给药也明显削弱了基因治疗心肌缺血的疗效,并且在理论上仍存有一定的安全隐患。而到目前为止,尚未有关于促血管生长因子基因靶向性转染心肌细胞研究方面的报道。 为研究促血管生长因子基因对心肌细胞转染的靶向性,本课题构建以 mlc-2v 为启动子、目的基因为 hVEGF165的重组腺病毒(Ad.mlc-hVEGF165),并同步构建以 mlc-2v为启动子、报告基因为 GFP 的重组腺病毒(Ad.mlc-GFP);以 Ad.mlc-GFP 体、内外转染心肌细胞,定性检测在心肌靶向性启动子 mlc-2v 作用下目的基因转染心肌细胞的靶向性;以 Ad.mlc-hVEGF165 体外转染心肌细胞,检测 VEGF 蛋白质的表达及其对血管内皮细胞的生物学效应,研究以 mlc-2v 为启动子的重组腺病毒转染心肌细胞后对目的基因表达的影响,为基因靶向性治疗心肌缺血等心脏疾病提供依据。方法:1.靶向性重组腺病毒载体(Ad.mlc-hVEGF165)的构建 酶切腺病毒穿梭质粒 PDC315 自身启动子 CMV,改造腺病毒穿梭质粒 PDC315 为PDC317,将基因 hVEGF165 和启动子 mlc-2v 酶切鉴定、测序正确后,装入载体 PDC317,置基因 hVEGF165于启动子 mlc-2v 控制之下,将重组质粒 PDC-MLC-VEGF 与 5 型腺病毒右臂的质粒 pBGHloxPΔE1E3 通过 Lipofectamine2000 共转染至 293 细胞,制备重组腺病毒 Ad.mlc-hVEGF165;同步构建腺病毒 Ad.hVEGF165、Ad.mlc-GFP 和 Ad.GFP。2. Ad.mlc-GFP 体外靶向性转染心肌细胞的实验研究 体外原代培养大鼠的心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞及骨骼肌细胞,传代 2<WP=7>第二军医大学博士学位论文 中文摘要 胸心外科专业培养 L-40 肝细胞,以 Ad.GFP 按不同 MOI 值体外转染心肌细胞,观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;以 Ad.GFP 和 Ad.mlc-GFP 体外分别转染上述细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪等观察 Ad.mlc-GFP 在体外转染的靶向性。3. Ad.mlc-GFP 体内靶向性转染心肌的实验研究 以 Ad.mlc-GFP 和 Ad.mlc-GFP 分别注射至大鼠的肝、肾、脾、心肌和骨骼肌组织内,通过荧光显微镜、共聚焦显微镜以及 PCR 的方法检测、分析 Ad.mlc-GFP 在体内转染的靶向性;4. Ad.mlc-hVEGF165 体外转染心肌细胞的实验研究 分离培养乳鼠心肌细胞,在同一 MOI 值下,Ad.mlc-hVEGF165 和 Ad.hVEGF165分别转染心肌细胞,以 RT-PCR 法和 Western 印迹分析法分别检测转染后心肌细胞内VEGF mRNA 的转录及 VEGF 蛋白的表达,以 ELISA 法检测转染后心肌细胞分泌的VEGF 蛋白质,MTT 等方法观察其对促内皮细胞增殖作用。研究以 mlc-2v 为启动子的重组腺病毒转染心肌细胞后对目的基因表达的影响。结果: 1.酶切和测序结果证明所获得的质粒(pBSK.mlc-2v 和 pcDNA3hVEGF165)正确,构建的腺病毒穿梭质粒 PDC317、PDC-mlc-VEGF 片断大小、方向正确,符合实验的要求。通过 Cre/LoxP 位点特异性重组系统成功地构建了腺病毒 Ad.mlc-hVEGF165,滴度为 2.8×109/ml,无野生性病毒生长。成功同步构建了腺病毒 Ad.hVEGF165、Ad.mlc-GFP、Ad.GFP。 2.原代培养获得了高纯度的乳鼠心肌细胞、血管内皮细胞、主动脉平滑肌细胞和骨骼肌细胞,细胞状态良好,传代的 L-40 肝细胞生长满意。随着 MOI 值的升高,Ad.GFP的转染效率和基因表达增强,在 MOI 值为 50 时,Ad.GFP 转染心肌细胞的效率高于90%,在 MOI 值为 200 时,未见心肌细胞的生长明显受抑。荧光显微镜、流式细胞仪检测显示在同一 MOI 值时,Ad.GFP 在转染上述细胞后均有绿色荧光的表达,在转染效率和基因表达方面各细胞间无差异;Ad.mlc-GFP 在转染上述细胞后,仅心肌细胞检可测到绿色荧光的表达,加大 MOI 值不能使除心肌细胞外的其余细胞表达绿色荧光,但可以提高心肌细胞的转染和表达;与 Ad.GFP 相比,Ad.mlc-GFP 的转染和表达有明显下降。 3.体内心肌靶向性检测的实验结果显示,在 Ad.GFP 组,各组织的切片在荧光显微 3<WP=8>第二军医大学博士学位论文 中文摘要 胸心外科专业镜下均可直接观察到绿色荧光的表达,其中以肝组织中荧光的强度最强;在Ad.mlc-GFP组中,仅有心肌组织表达绿色荧光。PCR 法检测 Ad.mlc-GFP 组中 GFP 的 DNA 含量,结果显示肝、肾、脾、心肌、骨骼肌组织中均存在 GFP 的 DNA,其中肝、肾、脾、骨骼肌组织中 DNA 含量相似,