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背景啮齿动物在人兽共患病的传播过程中起着重要作用,介导了多种传染病,包括细菌、病毒以及寄生虫类鼠传疾病。它们严重影响着人民健康和社会经济发展,是重要的公共卫生问题。本课题基于山东青岛地区收集的动物和人血清样本,运用分子生物学技术和免疫学手段,检测了该地区啮齿动物和人群中存在的部分病原体的感染率。同时,我们以伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）为代表,应用基因工程技术获得重组蛋白,分析重组蛋白在实验小鼠中的免疫原性,为抗原分子的疫苗候选以及药物靶分子的研究提供基础依据。目的（一）山东青岛地区鼠传疾病的流行病学研究1.捕获啮齿动物,并检测啮齿动物携带恙虫病东方体、布鲁氏菌、巴贝斯虫、伪狂犬病毒的情况。2.检测健康人群血清恙虫病抗体和布病抗体水平,了解恙虫病及布病在人群的流行情况。（二）伪狂犬重组蛋白的免疫效果研究1.构建伪狂犬病毒糖蛋白gB分段片段的表达载体,表达纯化目的蛋白。2.通过体外实验和体内实验,定位中和抗原表位,并检测其免疫原性和保护效果,为疫苗的研发提供实验依据。方法（一）山东青岛地区鼠传疾病的流行病学研究1.2012～2016年从山东青岛黄岛区收集啮齿动物,依据形态学检查进行分类,记录动物种类、捕获日期、捕获地点等信息,无菌解剖动物组织,分装冻存。提取动物脾脏DNA,用PCR扩增恙虫病东方体、布鲁氏菌、巴贝斯虫、伪狂犬病毒等。阳性产物经克隆和测序以及Blast比对,通过DNASTAR Lasergene中MegAlign软件进行同源性分析,用MEGA 7.0软件做进化树进行系统发育分析。2.用ELISA分别检测健康人群血清中恙虫病东方体、布鲁氏杆菌的抗体水平,用PCR检测东方体抗体阳性的血清中东方体DNA和布鲁氏杆菌抗体阳性的血清中布鲁氏杆菌DNA。（二）伪狂犬重组蛋白的免疫效果研究1.对PRV gB糖蛋白分段设计,构建各原核表达质粒,导入大肠杆菌中大量表达蛋白,使用AKTA层析系统亲和层析法和分子筛层析法纯化蛋白。2.将纯化后的各重组蛋白与等量佐剂混合免疫小鼠,取抗血清,用蚀斑减少中和实验检测小鼠血清中和抗体效价。分离小鼠脾脏淋巴细胞,经体外刺激培养,CCK-8检测淋巴细胞增殖活性,用ELIspot、qPCR检测脾淋巴细胞IFN-γ的分泌情况,用ELISA、qPCR检测脾细胞IL-4的分泌情况。3.按制定的免疫程序免疫小鼠后攻毒,连续21天观察小鼠的行为及生存状况,计算保护率。用PCR扩增死亡小鼠各组织DNA中PRV,确认死亡小鼠死于该病毒。结果（一）山东青岛地区鼠传疾病的流行病学研究1.从山东青岛黄岛区捕获的小动物共2目3科5属7种,为黑线姬鼠、黑线仓鼠、大仓鼠、小家鼠、褐家鼠、社鼠和大麝鼩。本研究的优势鼠种是黑线姬鼠,其次是小家鼠。黑线姬鼠同时也是野外捕获鼠的优势鼠种,而小家鼠和褐家鼠是室内捕获鼠的优势鼠种。所有的大仓鼠（18只）、社鼠（8只）、黑线仓鼠（7只）以及大多数黑线姬鼠（98.6%,69/70）捕自野外;大多数褐家鼠（91.7%,22/24）和多数小家鼠（66.7%,18/27）从室内获得。2.从162只动物脾脏中成功扩增出恙虫病东方体56-kDa TSA基因,未发现其他病原体。本研究恙虫病东方体的总携带率为4.3%（7/162）,阳性样本来自黑线姬鼠（4.3%,3/70）、小家鼠（7.4%,2/27）、社鼠（12.5%,1/8）和黑线仓鼠（14.3%,1/7）,均为秋季捕获。阳性黑线姬鼠（4.3%,3/69）、阳性社鼠（12.5%,1/8）和阳性黑线仓鼠（14.3%,1/7）均为野外捕获,阳性小家鼠（11.1%,2/18）为室内捕获。野外动物和室内动物恙虫病东方体携带率分别为4.2%和4.7%。3.本研究共得到7条恙虫病东方体56-kDa TSA的基因序列,进化树系统发育分析表明6株序列为Kawasaki型、1株为STA-07型。属于Kawasaki型的6株序列相互之间的同源性为91.7%～100%,与日本Kawasaki株（GenBank Number:M63383）的同源性为 91.4%～95.7%。4.本研究于2019年9～11月在山东青岛平度市共收集健康人血清229份,样本年龄集中在26～78岁之间,年龄中位数53岁。男性占66.4%,女性占33.6%,不同年龄组间性别分布无明显差异（P＞0.05）。5.本研究健康人血清中恙虫病总抗体（IgG和IgM）的阳性率为10.0%（23/229）,IgM抗体阳性率为3.1%（7/229）。在恙虫病总抗体阳性的样本中,19份来自男性,4份来自女性（性别比4.75）;且年龄均大于40岁,最大为70岁。恙虫病总抗体阳性的血清来自从事家畜饲养、农业种植、动物屠宰以及家禽饲养的人群,不同职业间恙虫病总抗体阳性率无明显差异（P＞0.05）。6.健康人血清中布鲁氏菌IgG抗体和IgM抗体的阳性率分别为3.1%（7/229）和2.6%（6/229）。在7份IgG抗体阳性的血清中,有6份血清IgM抗体同时阳性。抗体阳性的血清全部来自男性（40～年龄组和50～年龄组）。布鲁氏菌IgG抗体阳性的血清为从事农业种植、家畜饲养和家禽饲养的人群,不同职业间布鲁氏菌IgG抗体阳性率无明显差异（P＞0.05）。（二）伪狂犬重组蛋白的免疫效果研究1.gB全长分段截短后的片段为:gB-A（59aa～255aa）、gB-B（163aa～376aa）、gB-C（357aa～600aa）、gB-D（473aa～685aa）、gB-E（600aa～797aa）。本实验成功构建并表达了 5个重组质粒。经GST亲和层析和分子筛层析纯化,收集了纯度较高的各段目的蛋白Pr-A、Pr-B、Pr-C、Pr-D、Pr-E。2.小鼠依次免疫Pr-A、Pr-B、Pr-C、Pr-D、Pr-E重组蛋白及灭活病毒、平衡液 T,各组 PRNT50 依次为 16、64、16、64、256、＞256、＜4,认为 PE 组小鼠血清产生了较高水平的中和抗体。3.小鼠脾淋巴细胞经特异性刺激后,PE组小鼠脾细胞增殖程度显著高于对照组鼠脾淋巴细胞（P＜0.01）。PE组小鼠分泌IFN-γ的淋巴细胞数量明显高于对照鼠（P＜0.01）,PE组脾淋巴细胞中IFN-γ的相对含量升高显著高于对照组（P＜0.05）。PE组上清中IL-4的分泌水平与对照组无明显差异,PE组IL-4mRNA的相对含量的变化与对照组无明显差异。4.攻毒后,对照组小鼠第7天开始出现死亡,小鼠死亡前下身痉挛、腹部皮肤开始溃烂,第1 1天对照组小鼠全部死亡。PE组小鼠在21天观察期内行为正常,存活率100%。经PCR扩增确认,死亡小鼠均死于PRV攻击。结论1.本研究从室内捕获鼠中发现恙虫病东方体,说明人们在居住环境也有接触恙虫病东方体的风险。2.从健康人群血清中检测到恙虫病总抗体和IgM抗体阳性,以及人布病IgG和IgM抗体阳性,说明恙虫病及布病在青岛地区人群中具有一定流行性,当地政府应加强对这两种疾病的检测和监控。3.构建了伪狂犬gB分段片段的原核表达系统,表达并纯化了各片段目的蛋白。重组蛋白Pr-E（600aa～797aa）能诱导小鼠产生较高水平的中和抗体,能诱导较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有较好的免疫原性和保护效果。