黄萎病严重制约我国棉花产业的可持续发展,利用拮抗微生物防治黄萎病具有很大的发展潜力。本研究从黄萎病抗性棉(海7124)根际土壤中分离得到一株芽孢杆菌Bacillus sp.HT-7,通过平皿对峙实验、发酵液混合孢子共培养实验以及盆栽试验,证明菌株HT-7对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有较强的拮抗作用。通过代谢产物热稳定性及蛋白梯度沉淀抗菌活性实验检测其拮抗因子,结果表明,菌株HT-7主要拮抗因子是蛋白类物质,并分离出一个毒力蛋白,经鉴定分析可知,其与β-葡聚糖酶具有较高的同源性。将其在大肠杆菌BL21中表达,重组酶能明显抑制大丽轮枝菌的生长,说明葡聚糖酶是重要的拮抗毒力因子。利用过表达载体,实现β-葡聚糖酶基因在菌株HT-7中的大量表达,构建高效抗菌工程菌株,以此来达到更好的抗病效果。本研究的主要成果如下:1.拮抗芽孢杆菌的筛选及鉴定。通过稀释涂平板法,从黄萎病抗性棉(海7124)根系土壤中分离得到56株待测芽孢杆菌。平皿对峙实验显示,9株芽孢杆菌对大丽轮枝菌具有较强的抑制效果,其中菌株HT-7对大丽轮枝菌的拮抗效果最佳,抑菌率达40%。通过形态学和16S rDNA序列比对分析,发现其与菌株Bacillus vanillea XY18的相似度高达到99.86%。菌株HT-7发酵液与大丽轮枝菌孢子混合培养12 h,大丽轮枝菌孢子萌发抑制率为68%。盆栽实验表明,菌株HT-7可以显著提高陆地棉对黄萎病的抗性,与对照组相比发病率下降60%,病情指数降低82%。2.菌株HT-7毒力因子的检测。通过对菌株HT-7胞外代谢产物的热稳定性检测,得知其主要拮抗物质为热不稳定性类物质。对菌株的胞外蛋白进行分级盐析并做相应的抑菌实验,结果表明菌株HT-7的主要毒力因子为蛋白类物质。对潜在的活性蛋白进行质谱鉴定比对分析发现,其氨基酸序列与B.velezensis的糖基水解酶家族蛋白(WP-038460387)有99.59%的同源性,与B.amyloliquefaciens的β-葡聚糖酶(AAO43052)有97.94%的同源性,故推测菌株HT-7的主要毒力因子为β-葡聚糖酶。对菌株HT-7的生长曲线和β-葡聚糖酶活性进行测定,结果表明菌株HT-7摇瓶培养16 h后达到稳定期,β-葡聚糖酶活性在60 h时达到最高,酶活性为20 U/mL。收集菌株HT-7发酵液,每12 h取样,取至7 d,进行混合孢子实验,结果表明摇瓶培养60 h时收集的发酵液,抑菌效果最强,由此推断β-葡聚糖酶可能是菌株HT-7的一个毒力蛋白。3.β-葡聚糖酶基因的表达、纯化及抗菌活性检测。β-葡聚糖酶基因片段大小为732bp,编码243个氨基酸,通过构建表达载体,实现其在大肠杆菌中的大量表达,并利用Ni-NTA介质金属螯合亲和层析、SDS-PAGE电泳检测纯化分离目标蛋白。平板抑菌实验表明重组β-葡聚糖酶能有效抑制大丽轮枝菌的生长,其抑菌率达22.5%。同时β-葡聚糖酶对大丽轮枝菌孢子的萌发也有明显的抑制效果,并测得β-葡聚糖酶活为23.5 U/mL,进一步证明β-葡聚糖酶在菌株HT-7防治棉花黄萎病病原菌中发挥重要作用。4.过表达工程菌株的构建及其抗病活性检测。本研究利用分子生物学编辑技术构建过表达工程菌株CT-7,使β-葡聚糖酶基因在野生菌株HT-7中超量表达,增强抗病效果。Western杂交结果表明菌株CT-7中β-葡聚糖酶分泌量较野生菌株提高2.8倍。平皿对峙实验显示,菌株CT-7的抑菌率由野生菌的40%增加到65%。发酵液平板抑菌实验显示其抑菌圈直径达22 mm,抑菌率提高57%。盆栽实验中,菌株CT-7试验组的病情指数降低88%,发病率降低70%,防治效果高达91%,均高于野生菌株HT-7的防治效果,表明过表达菌株CT-7可以做为一种生防菌剂来防治棉花黄萎病。