铁皮石斛等兰科植物与微生物密切相关，内生菌对种子萌发、植物生长、抗逆和刺激次生代谢等都具有促进作用，因而倍受关注。20多年来，铁皮石斛内生真菌多样性及其功能研究与应用开发发展很快，但有关铁皮石斛内生细菌的研究报道较少。本论文运用微生物分子生态学方法结合传统分离培养法，对铁皮石斛根部和茎部内生细菌进行多态性和优势种群分析，以期为进一步探索内生细菌与铁皮石斛的互作奠定基础。目前，细菌分子生态学研究主要是基于16S rRNA基因多态性，为此本论文首先研究了铁皮石斛rRNA基因的多样性。采用细菌通用引物27f/1492r PCR扩增铁皮石斛田间样品和组培苗基因组DNA，获得2000bp的线粒体18S rRNA基因和约1200bp、1500bp的叶绿体16S rRNA基因序列。BLAST分析表明，铁皮石斛线粒体18S rRNA基因与芦笋线粒体18S rRNA基因的相似性为99%，叶绿体16S rRNA基因与石斛属、小兰屿蝴蝶兰的叶绿体16S rRNA基因的相似性为100%。铁皮石斛线粒体18S rRNA基因、叶绿体16S rRNA基因与E.coli16S rRNA基因序列的相似度分别为59.5%和70.3%。将细菌常用16S rRNA基因通用引物序列与铁皮石斛rRNA基因序列分别比对，其碱基几乎完全匹配。该结论解释了常用细菌通用引物能从铁皮石斛中扩增出大量rRNA基因的原因。可见，铁皮石斛内具有丰富的rRNA基因，因此进行铁皮石斛内生细菌的多样性分析需要设计特异性引物。根据数据库中不同属的细菌16S rRNA基因序列，参考铁皮石斛rRNA基因序列，设计内生细菌特异性引物。分别设计可以区分线粒体18S rRNA基因和叶绿体16S rRNA基因的引物，共计5条上游引物和6条下游引物。通过筛选，确定特异性和通用性均较好的引物对fM1/rC5作为巢式PCR第一次扩增引物。同时，根据巢式引物设计原则和DGGE电泳对扩增产物要求，确定f515-GC和rC5作为第二次扩增引物对。采用巢式PCR-DGGE法对铁皮石斛内生细菌的分子多态性进行分析。结果显示，从萧山铁皮石斛根部和茎部、奉化根部和茎部、庆元根部和茎部分别获得DGGE条带数为16、12、13、13、13和11。对其中代表不同菌株的31个条带进行测序鉴定，结果发现伯克氏菌属、假单胞菌属、鞘脂单胞菌属和新鞘脂菌属的内生细菌数量较多。根据DGGE条带亮度，确定优势内生细菌分别为伯克氏菌属、假单胞菌属、鞘脂单胞菌属、新鞘脂菌属、沙雷氏菌属和梭菌属。可见，铁皮石斛内生细菌多样性较为丰富，且因产地、组织的不同呈现分子多态性。采用传统分离培养法，分析了铁皮石斛可培养内生细菌的多态性及优势种群。从萧山、奉化、庆元三地铁皮石斛中分离到内生细菌共计134株。依据分离物出现频率及生长速度，筛选出优势内生细菌11株，进行进一步鉴定和酶活性检测。鉴定结果显示，11株优势菌株中有9株属于芽孢杆菌属，其中苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、假单胞菌在农业上已有较为深入的研究与应用。酶活性检测结果显示，11株优势内生细菌中5株有蛋白酶活性，4株有淀粉酶活性，4株有卵磷脂酶活性，4株有固氮酶活性。这些菌株与铁皮石斛的相互作用及其对品质和产量的影响正在研究中。综上所述，本论文运用分子生态学结合传统分离培养法，对铁皮石斛内生细菌的多态性和优势种群进行了分析，表明铁皮石斛内生细菌因产地和组织不同存在多态性，其中分子多态性和可培养内生细菌多态性存在差别，产生这种差别的原因有待进一步分析。总之，本论文铁皮石斛内生细菌的多态性分析为后续内生细菌与植物互作研究奠定了基础。