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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是伴随衰老出现的第二大常见的神经退行性疾病。运动迟缓,肌强直,姿势异常,静止性震颤是其主要临床表现。中脑黑质致密部(substantia nigra pars compact,SNc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性、丢失,残存神经元内出现由α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集形成的路易小体(Lewy body,LB)是其主要病理特征。α-Syn是一种突触前蛋白,主要参与突触的可塑性及DA转运。其突变后的异常聚集,对细胞产生毒性,最终会导致细胞死亡。α-Syn异常聚集引起的细胞损伤是PD发生的核心机制。目前治疗主要以左旋多巴制剂对症治疗为主,该疗法虽然能缓解大部分PD患者的运动症状,但长期服用具有严重的副作用和明显的疗效衰减。不能有效阻止或延缓PD进展。传统中医药在治疗PD方面具有丰富的经验和方法,然而仍存在疗效慢,缓解主要症状不明显,起效机制不明确等问题。因此干预PD关键病理机制,延缓疾病进展的药物研究成为当前神经科学研究领域的重点和热点。红景天苷(对-羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷,Salidroside,Sal),是景天科(Crassulacea)红景天属(Rhodiola rosea L)植物的主要活性成分,具有广泛的药理作用包括抗氧化,抗炎,抗肿瘤,抗疲劳作用。我们以前的研究发现在MPP+诱导的PD体外模型下,Sal预处理能通过调控NO通路、PI3K/AKT通路保护PC12细胞,对抗MPP+诱导的凋亡。Sal通过调节ROS-NO相关的线粒体通路保护PC12细胞与小鼠DA能神经元对抗MPP+/MPTP诱导的凋亡。此外,Sal能抑制α-syn的过度聚集,然而对于Sal抑制或清除PD病理性α-syn的机制依然未知。正常大脑组织里,α-syn蛋白中只有4%是在Serine129位磷酸化的α-syn(p Ser129-α-syn)。病理情况下,组成LB的α-syn中有接近90%是p Ser129-α-syn。编码α-syn的SNCA基因的错义点突变如A30P、A53T能引起常染色体显性遗传的早发性PD。过表达WT/A30P/A53T-α-syn转基因小鼠的研究显示运动缺陷与神经变性的改变,减少α-syn在神经元中的异常聚集能抑制神经元包涵体的形成以及疾病的进展。泛素蛋白酶体系统(UPS)与自噬溶酶体通路(ALP)是维持真核细胞内蛋白平衡的两条主要通路。研究认为,WT/A30P/A53T-α-syn既可以通过UPS降解也可以通过ALP降解。小鼠PD模型研究显示UPS是降解内源性以及过表达α-syn的主要途径,UPS损伤所导致的细胞内蛋白质平衡的紊乱被认为是PD发生的主要原因,而维持UPS正常的功能被认为是减缓PD进展,保护神经元的关键靶点。本次研究,我们在SH-SY5Y细胞上采用6-OHDA诱导和WT/A30P-α-syn转染建立PD模型研究Sal是否具有改善UPS功能,抑制或清除病理性p Ser129-α-syn/α-syn,保护神经细胞的作用。目的:(1)建立6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞PD模型,探讨Sal是否具有保护细胞活性,抑制p Ser129-α-syn产生的作用及背后机制。(2)建立WT/A30P-α-syn转染诱导SH-SY5Y细胞α-syn过表达的PD模型,探讨Sal是否具有保护SH-SY5Y细胞,清除WT/A30P-α-syn的作用及背后机制。方法:MTT比色法检测细胞活性,蛋白印迹及免疫细胞化学实验检测目的蛋白表达,蛋白酶体活性检测法检测20S蛋白酶体活性,质粒转染构建α-syn过表达模型。结果:(1)6-OHDA处理SH-SY5Y细胞以剂量依赖的方式引起细胞活性下降,同时升高p Ser129-α-syn水平,Sal预处理明显改善细胞活性,抑制p Ser129-α-syn升高。6-OHDA(100μM)处理引起20S蛋白酶体活性和Free ubiquitin、PARKIN、UCH-L1蛋白水平分别下降至41.0±6.2%、40.4±6.3%、38.9±7.9%、41.6±2.8%(P<0.01),以及升高HMW-ubiquitinated proteins水平至201.5±15.5%(P<0.01)。Sal(40μM)预处理分别提高20S蛋白酶体活性、Free ubiquitin、PARKIN与UCH-L1蛋白水平至81.0±6.1%(P<0.01)、84.9±12.0%(P<0.05)、77.6±6.5%(P<0.01)和83.5±7.4%(P<0.01),此外,Sal预处理降低HMW-ubiquitinated proteins水平至118.8±17.4%(P<0.05)。使用MG132抑制蛋白酶体活性后,Sal降低p Ser129-α-syn水平的作用消失(P<0.01)。HCQ抑制ALP后不影响Sal对p Ser129-α-syn水平的调节作用(P>0.05)。同时抑制蛋白酶体活性与ALP后,Sal降低p Ser129-α-syn水平的作用消失(P<0.01)。(2)SH-SY5Y细胞转染WT/A30P-α-syn 24h,然后Sal(40μM)处理24h,α-syn蛋白水平明显下降(P<0.01)。WT/A30P-α-syn转染以及Sal处理对PARKIN、UCH-L1蛋白水平没有影响(P>0.05)。WT/A30P-α-syn转染后用Sal处理使α-syn蛋白水平分别下降至35.3±7.4%和34.0±7.0%(P<0.01)。MG132抑制蛋白酶体活性后,α-syn蛋白水平分别升高至203.0±14.8%与218.0±15.1%(P<0.01)。蛋白酶体活性检测显示,细胞转染WT/A30P-α-syn后,20S蛋白酶体活性分别下降至49.7±4.9%与44.0±4.0%(P<0.01),Sal处理后分别上升至75.7±6.1%(P<0.01)、66.7±7.0%(P<0.05),Sal与MG132同时处理细胞后,又下降至26.0±2.9%与26.7±4.7%(P<0.01)。MTT检测显示,WT/A30P-α-syn转染24h后细胞活性分别下降至62.0±3.1%与57.5±2.4%(P<0.01),Sal处理后细胞活性分别升高至75.6±2.3%(P<0.01)、69.7±4.1%(P<0.05),MG132抑制蛋白酶体活性后,Sal调节的细胞活性分别下降至51.0±5.7%和43.8±2.5%(P<0.01)。HCQ抑制ALP未明显影响Sal对WT/A30P-α-syn蛋白水平的调节作用(P>0.05)。同时抑制蛋白酶体与ALP后,Sal调节的WT/A30P-α-syn蛋白水平分别增加至258.7±28.9%与179.0±11.6%(P<0.01)。结论:(1)Sal减轻6-OHDA诱导的细胞毒性,通过改善UPS功能抑制p Ser129-α-syn水平的升高。(2)Sal主要通过提高20S蛋白酶体活性,清除WT/A30P-α-syn,发挥细胞保护作用。