关节软骨病变是骨科的常见疾病，且多数软骨病变合并软骨下骨的病变自今仍无理想的治疗方法。组织工程技术是目前最有希望的方法。但目前软骨组织工程还存在不能同时修复软骨下骨、工程软骨与周围软骨及软骨下骨交界区整合不良、工程软骨固定不牢、即时力学缺陷及远期退变等问题。因此，构建一体化的组织工程骨软骨，能同时修复软骨下骨与骨、固定牢靠和即时稳定性和良好力学性能是目前组织工程软骨研究的方向和热点。为此，我们设计了一种分层脱钙松质骨支架，上层完全脱钙作为软骨组织工程支架，下层不脱钙作为骨修复支架，利用下层骨修复比软骨修复快的特点，实现工程骨软骨的牢固固定和界面整合，同时上层利用藻酸凝胶作为二级支架分布细胞，构建组织工程骨软骨，修复软骨或者骨软骨病变或缺损。本实验利用牛股骨远端松质骨作为支架的原材料，经脱脂、脱细胞和分层脱钙等步骤制备骨软骨组织工程一体化支架。以新西兰大白兔为实验动物，藻酸钙凝胶包埋自体软骨细胞，加载到支架上层，构建“种子细胞-支架材料”复合物，体外培养后植入兔膝关节全层软骨缺损模型中。不同时期观察膝关节全层软骨缺损的修复情况，探讨组织工程骨软骨修复关节全层软骨缺损的可行性。取新鲜牛股骨远端干骺端松质骨用体积比1:1甲醇/氯仿脱脂，100g·L-1NaCl与1%TritonX-100联合脱细胞，骨蜡部分包埋松质骨柱上半部分进行分层脱钙，制备分层脱钙一体化支架材料。支架进行HE染色、扫描电镜观察，并检测孔隙率、溶胀率率和降解率。实验用24只新西兰大白兔，以每个膝关节为一个单位，平均分成三组(n=16)：空白对照组、单纯支架组和实验（自体软骨细胞-分层脱钙松质骨支架）组，每只兔的两个膝关节在不同组别。兔股骨滑车处造一个直径4.0mm，深达骨髓腔的关节全层软骨缺损模型。空白对照组缺损旷置处理。单纯支架组在缺损部位植入制备的直径4.0mm分层脱钙松质骨支架。实验组植入藻酸凝胶包埋自体软骨细胞-分层脱钙松质骨支架复合物。于实验术后3个月、6个月后分别处死、取材，大体观察评分，HE、番红O、甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组化染色等病理学检测，观察关节软骨缺损的修复情况，并进行病理评分。实验研制的支架的孔隙直径为（358.53±79.67）μm,孔隙率为（85.55±4.66）%,溶胀率为(67.68±8.83）%，约10~12周降解完全。动物实验组织病理学检测显示，3个月时空白对照组动物的关节全层软骨缺损并未得到明显修复，大体观察评分为（0±0）分，Wakitani病理评分为(11.75±1.39)分。单纯支架组动物的关节全层软骨缺损由纤维组织进行一定程度的修复，部分区域修复不完整，大体观察评分为（2.00±1.41）分，Wakitani病理评分为（7.50±0.53）分。实验组动物的关节全层软骨缺损修复较好，表面比较平整，可见软骨样组织修复缺损区域，但部分动物缺损修复区域边缘整合不佳，大体观察评分为（3.25±1.39）分，Wakitani病理评分为（3.87±1.55）分。实验组关节全层软骨缺损修复效果与空白对照组、单纯支架组比较，差异具有统计学意义（P <0.01）。6个月时空白对照组动物的关节全层软骨缺损得到轻度修复,仍见部分缺损，大体观察评分为（1.00±0）分，Wakitani病理评分为（10.75±1.39）分。单纯支架组动物的关节全层软骨缺损由纤维组织进行修复，少量区域修复不完整，较3个月前明显改善，大体观察评分为（3.75±1.91）分，Wakitani病理评分为（6.25±1.39）分。实验组动物的关节全层软骨缺损修复较好，表面接近平整，可见到软骨样组织修复缺损区域，缺损修复区域边缘整合较好，软骨厚度较前增加，大体观察评分为（6.13±2.53）分，Wakitani病理评分为（2.25±0.71）分。实验组关节全层软骨缺损修复效果与空白对照组、单纯支架组比较，差异具有统计学意义（P <0.01）。利用牛松质骨制备的分层脱钙松质骨支架，同时上层利用藻酸凝胶作为二级支架分布细胞，构建组织工程骨软骨，较好地修复了兔膝关节骨软骨缺损，为治疗关节全层软骨缺损提供了一种新选择。