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膝关节交叉韧带损伤后愈合能力差一直是骨科临床治疗面临的难题。因此从分子水平阐明交叉韧带难以愈合的原因至关重要。交叉韧带受到损伤的同时滑膜也会受到不同程度损伤。动物实验发现前交叉韧带(Anterior cruciate ligament, ACL)损伤后,与关节腔内其它组织(如：后交叉韧带(Posterior cruciate ligament, PCL)、半月板和软骨)相比,滑膜向关节液释放了最大量活化形式的基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs),因而被认为是交叉韧带损伤后关节腔内微环境的主要调节者。为了进一步更深入的探讨滑膜的关节腔微环境调控作用,我们体外模拟交叉韧带损伤后关节腔内微环境,在细胞水平上研究力-化学因素刺激下,滑膜成纤维细胞中赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidases, LOXs)和MMPs的表达以及MMP-2活性。本文主要研究工作及结果如下：①TNF-α和IL-1β对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs表达以及MMP-2活性的影响炎症因子被认为是炎症反应时期重要的化学调节者。研究结果显示lOng/ml TNF-α抑制了滑膜成纤维细胞中LOXs的表达10ng/ml IL-1β上调了LOX、LOXL-1和LOXL-3的表达,下调了LOXL-2和LOXL-4的表达。TNF-α和IL-1β分别上调了MMP-1,2,3的表达。TNF-α与IL-1β的结合不同程度地抑制了LOXs的表达,却以协同方式大大促进了MMP-1,2,3的表达。明胶酶谱实验指出TNF-α和IL-1β的结合进一步以剂量和时间依赖性形式诱导了MMP-2活性的增加,且MMP-2活性高于TNF-α和IL-1β的单独促进作用。炎症因子刺激下,滑膜成纤维细胞中表达失衡的LOXs和MMPs分泌进入关节液,造成关节腔中交叉韧带重塑过程的失衡,这可能是导致受损交叉韧带无法愈合的一个重要原因。说明受损交叉韧带无法愈合不仅与其自身因素有关,还与韧带损伤后关节腔内微环境的改变有关,其中滑膜对于关节腔内微环境的改变起着重要的调控作用。因此在研究交叉韧带修复工作中,滑膜是不能被忽视的。②损伤性力学拉伸作用下TNF-α对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs表达以及MMP-2活性的影响在正常生理环境下,力学刺激是和关节腔内其它因子共同作用来引发损伤级联反应的。结果显示12%损伤性力学拉伸抑制了LOXs(除LOXL-2)的表达,却上调了MMP-1,2,3的表达。与10ng/ml的TNF-α相似,5ng/ml的TNF-α仍然抑制了LOXs的表达,促进了MMP-1,2,3的表达。在5ng/mlTNF-α存在的情况下,滑膜成纤维细胞受到损伤性力学拉伸的第1,2,3个小时里表现出的LOXs表达量的上调受到抑制,之后在6h时,LOXs表达量降到对照组水平以下。相反,损伤性力学拉伸与TNF-α以协同作用方式促进了MMP-1,2,3的表达以及MMP-2的活性。此外,体外划痕实验显示TNF-α抑制了细胞的迁移。在力学损伤和炎症因子共同作用下,滑膜成纤维细胞中表达失衡的LOXs和MMPs释放入滑液中引起关节腔微环境的变化,引起受损交叉韧带细胞外基质合成与降解的失衡,不利于韧带修复。以上结果说明除了交叉韧带自身因素外,关节腔中微环境的改变也影响着韧带的愈合能力。此外,研究结果还指出滑膜成纤维细胞对力学因子和炎症因子非常敏感,并且在调节关节腔微环境中起着重要作用。因此在研究交叉韧带修复工作中,滑膜是不能被忽视的。③损伤性力学拉伸和TGF-β1对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMP-1,2,3表达以及MMP-2活性的影响在韧带愈合的炎症反应期,不仅炎症因子(TNF-α和IL-1β)而且生长因子(如TGF-β1)也参与了韧带的修复。结果显示损伤性力学拉伸抑制了LOXs(除LOXL-2)的表达,而TGF-β1上调了LOXs的表达。损伤性力学拉伸和’TGF-β1分别上调了MMP-1,2,3的表达。损伤性力学拉伸与TGF-β1共同作用,促进了LOXs(除LOXL-1)和MMP-1,2,3的表达,并且MMPs的上调程度大于LOXs的上调程度。此外,损伤性力学拉伸与TGF-β1结合,以时间依赖性方式大大促进了MMP-2的活性,明显超过了力因子单独对MMP-2的作用。在力学损伤和生长因子共同作用下,相对于LOXs的表达水平,滑膜成纤维细胞中更高的MMPs表达和活性破坏了交叉韧带细胞外基质重塑过程的平衡状态,不利于韧带修复。以上结果除了说明交叉韧带受损后关节腔微环境改变对韧带愈合的不利影响外,也说明滑膜在关节腔微环境调控过程中起着重要作用,并且其作用的发挥受力因子和生长因子的共同影响。因此,滑膜在韧带愈合过程中的作用越来越重要,不能被忽视。④NF-κB信号通路介导了损伤性力学拉伸和TGF-β1对滑膜成纤维细胞中MMP-2活性的调节过程利用信号通路抑制剂来研究损伤性力学拉伸和TGF-β1调控滑膜成纤维细胞中MMP-2表达的主要信号通路。结果显示由于NF-κB信号通路抑制剂Bay11-7082和Bay11-7085的加入,损伤性力学拉伸和TGF-β1诱导的滑膜成纤维细胞中MMP-2的活性被抑制。⑤为了更真实的模拟体内环境,实验建立共培养体系,研究共培养环境下,滑膜细胞对PCL细胞中LOXs的直接性的调节作用,结果显示相比单培养而言,共培养促进了PCL细胞中LOXs的表达。这一结果直接表明了滑膜与PCL之间有交流,并且更加说明滑膜作为微环境调节者参与了交叉韧带的愈合。综上所述,交叉韧带损伤后关节腔微环境的改变可能是导致其自身修复失败的重要原因,并且滑膜通过对关节腔内微环境的调控参与了交叉韧带的愈合过程。因此通过调节滑膜中LOXs和MMPs的表达来改善关节腔微环境对于提高交叉韧带愈合能力具有重要意义。