α-淀粉酶能切断淀粉分子中的α-1,4-葡萄糖苷键,并将淀粉水解为可溶性糊精、低聚糖及麦芽糖和葡萄糖,在制药、纺织、食品以及洗涤剂等行业有着广泛的应用。其中,来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）α-淀粉酶由于具有优良的热稳定性而被广泛的应用于淀粉的喷射液化工艺中。然而,由于该淀粉酶热稳定性依赖Ca²⁺,液化过程中需要额外添加一定浓度的Ca²⁺来保持稳定性。本实验室前期筛选得到一株嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）WSH13-17,其所产α-淀粉酶（也叫麦芽六糖α-淀粉酶）具有催化效率高（约为B.licheniformisα-淀粉酶的8倍）,热稳定性对钙离子依赖程度低等优点。然而,由于野生酶在高温条件下的稳定性较差,不能满足工业化应用要求。因此本论文将重组表达来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因AmyMH,通过发酵优化提高产酶水平,同时针对重组酶热稳定性偏低的问题,通过定点突变手段定向改造酶的热稳定性,并对相关机理进行探究。进一步在原有突变的基础上,通过在突变体的N端融合寡肽的方法,继续提高酶的应用性能。主要研究结果如下:（1）研究了B.stearothermophilusα-淀粉酶（AmyMH）在大肠杆菌（Escherichia coli）中的重组表达及酶学性质。将B.stearothermophilusα-淀粉酶编码基因AmyMH按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化,构建了表达AmyMH基因的重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-24a-AmyMH,并考察了不同信号肽介导对重组菌产酶的影响。结果表明,PelB信号肽介导的菌株所产胞外α-淀粉酶活力最高,为782 U·m L^-1,是原始信号肽介导的4.5倍。摇瓶发酵过程中发现,大肠杆菌菌体浓度与重组酶活力成一定的反比关系。摇瓶发酵样品的透射电镜结果表明,大部分重组大肠杆菌细胞已坏死,细胞内形成很多空洞,只有少部分菌体细胞的组织结构基本存在,而表达失活AmyMH的大肠杆菌细胞形态则较为正常,说明AmyMH的表达对大肠杆菌细胞有一定的毒害作用。将AmyMH在可以表达对大肠杆菌有毒性蛋白的菌株E.coli C41（DE3）中进行重组表达,结果显示胞外最高α-淀粉酶活力为1560 U·mL^-1,是BL21（DE3）表达的2倍。对重组酶进行纯化和酶学性质分析,结果显示重组酶的最适反应温度和最适反应pH分别为70℃和5.0;以可溶性淀粉为底物时的比活力、k_cat、K_m和k_cat/K_m分别为5.3×10⁴ U·mg^-1、6.5×10⁴ s^-1、2.1 g·L^-1和3.1×10⁴ g·L^-1·s^-1。在95℃、pH 6.0、1 mM Ca²⁺条件下重组酶的半衰期为60 min,而在更高的110℃条件下,重组酶的迅速失活,不能满足工业应用要求。（2）研究了AmyMH在短小芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis）中的重组表达,并通过发酵优化提高产酶水平。构建了带有α-淀粉酶编码基因AmyMH的重组菌B.choshinensis/pNCMO2-AmyMH,摇瓶的初步发酵结果显示,发酵上清中酶活力为2149 U·mL^-1,是大肠杆菌C41发酵的1.4倍。对重组短小芽孢杆菌的摇瓶发酵条件和培养基组分进行优化,优化后发酵酶活力可达1.72×10⁴ U·mL^-1,是未优化前的8倍。在摇瓶优化实验中发现,脯氨酸可以明显促进重组酶AmyMH的表达,流式细胞仪分析结果表明,脯氨酸可以对细胞保持良好状态,延长发酵稳定期有促进作用。并且实验结果表明,脯氨酸对重组菌产酶的促进作用具有一定的普遍性。（3）探讨了重组酶结构域B中非保守区域天冬酰胺突变对重组酶热稳定性的影响。据报道,结构域B对α-淀粉酶稳定性有着重要的影响,并且天冬酰胺的脱酰胺作用是导致α-淀粉酶在高温条件下失活的原因之一。通过氨基酸序列比对,选取了结构域B中的3个非保守天冬酰胺（Asn122、Asn149和Asn193）作为研究目标,构建了5个突变体（N122D、N149S、N149D、N193H和N193F）。热稳定性分析表明,在5个突变体中,突变体N193F的热稳定性提升最为明显,在95℃、pH 6.0、1 mM Ca²⁺情况下的半衰期为2 h,是野生酶的2倍。蛋白模拟结构显示,Asn193位于一段一段环绕Ca²⁺-Na⁺-Ca²⁺结构的长Loop上,而Ca²⁺-Na⁺-Ca²⁺附近结构的稳定对α-淀粉酶整体结构的稳定有着至关重要的作用,因此推测这段Loop对重组酶的稳定性有着重要的影响。（4）通过固定结构域B中178-200位Loop提高AmyMH的热稳定性。基于蛋白质模拟结构分析和比对,选取了Loop上及附近4个可能对重组酶AmyMH稳定性有影响的位点（Pro245,Ser242,Gly180和Ile181）,构建了5个AmyMH突变体（ΔIG,S242A,ΔIG/N193F,ΔIG/N193F/P245R和ΔIG/N193F/S242A）。EDTA对野生酶和突变体的活性均有不同程度的抑制作用,其中突变体ΔIG/N193F/S242A的抑制效果最弱。并且,经过10 mM EDTA、60℃处理后,突变体ΔIG/N193F/S242A的残留活性最高,为60%,说明该突变体的Ca²⁺结合能力最强。突变体ΔIG,S242A,ΔIG/N193F和ΔIG/N193F/S242A的热稳定性较野生酶均有不同程度的提高。其中,突变体ΔIG/N193F/S242A的稳定性最好,在95℃、pH 6.0、1 mM Ca²⁺条件下半衰期为300 min,是野生酶的5倍,而在不含有Ca²⁺条件下突变体的半衰期为210 min,是野生酶的26倍。进一步对BLA中相似Loop进行研究,构建突变体,其中三突变体A269K/S187D/N188T的稳定性最好,在95℃、pH 5.5、10 mM Ca²⁺条件下半衰期为270 min,是野生酶的9倍。BLA稳定性的提高说明相似Loop的固定对α-淀粉酶热稳定性的提升有着一定的普遍性。（5）将突变体ΔIG/N193F/S242A的N端分别与4种寡肽进行融合,对融合后重组蛋白的酶学性质进行研究。融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A对EDTA的耐受性得到加强,而其他三种融合蛋白对EDTA的耐受性没有得到提升。融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A的热稳定性较对照有着明显的提升,在95℃、p H 6.0、1 mM Ca²⁺条件下处理8 h后,融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A的残留活性为58%,而对照仅为37%。在更高温度条件下（110℃）,融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A与商品酶热稳定性对比发现,在低浓度Ca²⁺存在的条件下（1和5 mM）,融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A的残留活性分别为64.6%和63.5%,而商品酶的残留活性则分别为5.2%和58.2%。OP1-ΔIG/N193F/S242A在低浓度钙离子条件下的稳定性要优于商品酶。