研究目的:程序性死亡受体-1(Programmed death-1,PD-1)及其配体(Programmed death ligand-1,PD-L1)结合后形成免疫抑制性微环境,在肿瘤免疫逃逸过程中发挥关键作用,多个基于阻断PD-1/PD-L1结合的单克隆抗体药物已被批准用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等恶性肿瘤的治疗。但这一类免疫检查点抑制剂在应用过程中会发生免疫相关不良反应(Immune-related adverse events,ir AEs),可累及机体各个器官和组织,病情严重时会危及生命。目前主要使用糖皮质激素来预防和减缓ir AEs的发生。糖皮质激素对免疫系统具有抑制作用,因此,糖皮质激素是否对免疫检查点抑制剂的治疗效果产生负性影响,是临床上极为关注的问题。有临床回顾性分析提示治疗剂量下糖皮质激素削弱了PD-1/PD-L1单抗对非小细胞肺癌的治疗效果,而在黑色素瘤中糖皮质激素对免疫治疗无显著影响。针对PD-1/PD-L1的免疫治疗发挥作用的前提是免疫抑制的形成,因此,肿瘤细胞PDL1的表达是决定其治疗效果的另一关键因素。目前未见文献报导糖皮质激素对肿瘤细胞PD-L1表达的影响。本研究旨在考察糖皮质激素对肿瘤细胞PD-L1表达的调控作用,从肿瘤细胞角度探究糖皮质激素对免疫治疗效果的潜在影响,为临床糖皮质激素的应用是否对免疫治疗产生不利影响提供实验依据。研究方法:采用人源非小细胞肺癌NCI-H292细胞和A549细胞、人源黑色素瘤A2058细胞和A375细胞及人源肾癌786-O细胞和769-P细胞作为细胞模型评价糖皮质激素对肿瘤细胞上PD-L1表达的调控作用。1)分别在基础水平和IFNγ诱导PD-L1上调模型中考察地塞米松对肿瘤细胞上PD-L1蛋白表达的影响;2)在NCI-H292上检测PD-L1蛋白表达随地塞米松作用时间的变化;3)在IFNγ诱导模型中考察浓度梯度的地塞米松对NCI-H292细胞和A549细胞上PD-L1蛋白水平的影响;4)采用流式细胞术考察地塞米松对非小细胞肺癌细胞表面蛋白CD274的影响;5)采用糖皮质激素作用于NCI-H292、A2058和786-O考察糖皮质激素对PD-L1的影响;6)通过蛋白合成抑制剂CHX(Cycloheximide,CHX)阻止细胞内蛋白的从头合成,并结合Western Blot检测地塞米松在基础水平和IFNγ诱导模型中对NCIH292细胞上PD-L1降解速率的影响,并对结果做统计分析;7)进而用蛋白酶体抑制剂MG132阻止PD-L1蛋白的泛素化降解,或用溶酶体抑制剂CQ抑制PD-L1蛋白的溶酶体途径降解,结合Western Blot检测地塞米松在基础水平和IFNγ诱导模型中对PD-L1蛋白的影响;8)在基础水平和IFNγ诱导模型中分别给予地塞米松,结合q-PCR考察地塞米松对PD-L1转录水平的影响。采用人源非小细胞肺癌NCI-H292细胞、人源黑色素瘤A2058细胞以及人源肾癌786-O细胞,探究糖皮质激素调控肿瘤细胞PD-L1表达的分子机制。1)收集肿瘤细胞裂解液检测肿瘤细胞上糖皮质激素受体的表达水平;2)通过q-PCR检测NCI-H292细胞上地塞米松、安息缩松和倍他米松对GR下游靶基因的激活情况;3)采用人源黑色素瘤A2058细胞以及人源肾癌786-O细胞,结合q-PCR检测地塞米松对GR下游靶基因的激活水平;4)检测PD-L1的经典上游调控蛋白IRF1的表达水平以及Stat1的总蛋白水平及其磷酸化水平变化。在体外采用鼠源性肿瘤细胞考察糖皮质激素对PD-L1的调控作用,并通过体内实验初步考察糖皮质激素受体与PD-L1表达的相关性。1)在鼠源性结肠癌MC38细胞、鼠源性肺癌LLC细胞和鼠源性黑色素瘤B16细胞中通过Western Blot法检测不同浓度的地塞米松对PD-L1蛋白表达水平的影响;2)采用鼠源性结肠癌MC38细胞,在基础水平和IFNγ诱导模型中分别考察糖皮质激素对PD-L1的调控作用。3)采用MC38腋下接种模型和LLC移植瘤模型考察肿瘤细胞经过免疫监视后其GR和PD-L1表达水平的变化。研究结果:糖皮质激素能够显著抑制非小细胞肺癌细胞PD-L1的蛋白表达,但不影响肾癌细胞和黑色素瘤细胞PD-L1蛋白表达。Western Blot结果显示,在NCI-H292细胞上给予地塞米松可下调PD-L1的蛋白水平;在A549和NCI-H292的IFNγ诱导模型中,地塞米松显著抑制IFNγ引起的PD-L1蛋白的上调。为进一步明确地塞米松对PD-L1蛋白表达的抑制作用,我们考察地塞米松在非小细胞肺癌细胞上的时效关系和量效关系。结果显示,在IFNγ诱导模型中,地塞米松浓度依赖性下调PDL1的蛋白水平。随着地塞米松作用时间增加,PD-L1的蛋白水平逐渐降低。由于PD-L1主要是在肿瘤细胞膜表面发挥作用,因此我们通过流式细胞术检测地塞米松对肿瘤细胞膜表面PD-L1蛋白(即CD274)的抑制作用。结果显示,在A549细胞中,与对照组中PD-L1的相对荧光强度百分比1.27±0.13%相比,给药组(地塞米松)总PD-L1的百分比降低至0.83±0.28%(p=0.0488)。在IFNγ诱导模型中,IFNγ组总PD-L1的百分比显著增加至7.70±2.36%(p=0.0027),证明IFNγ诱导模型构建成功。在IFNγ刺激下同时给予地塞米松作用后,CD274的荧光百分比从7.70±2.36%下调至0.99±0.70%(p=0.0059)。将临床常用的糖皮质激素作用于H292细胞后,Western Blot结果显示地塞米松、泼尼松龙、安息缩松和倍他米松均可不同程度下调PD-L1的蛋白水平。同时我们也在其他肿瘤细胞上考察了糖皮质激素对PD-L1的调控作用。结果显示,在黑色素瘤A2058细胞和A375细胞及肾癌786-O细胞和769-P细胞上,糖皮质激素均不影响PD-L1的表达水平。进而我们通过考察PD-L1的稳定性及转录水平来进一步探究糖皮质激素对肺癌细胞上PD-L1的表达调控。Western Blot结果显示,在基础水平或是IFNγ诱导模型中,加入地塞米松并没有显著影响PD-L1的降解;结合q-PCR结果显示,在H292中,地塞米松(1μM)、强的松(1μM)、泼尼松龙(1μM)、安息缩松(1μM)和倍他米松(1μM)分别下调PD-L1转录水平5.33±0.04倍(p<0.0001),5.27±0.03倍(p<0.0001),4.70±0.02倍(p<0.0001),8.36±0.04倍(p<0.0001)。在IFNγ诱导模型中,地塞米松(1μM)作用于A549和H292细胞中可分别下调PD-L1的转录水平7.61±0.12倍(p=0.0001)和1.66±2.40倍(p=0.0200)。糖皮质激素通过抑制Stat1 Ser701磷酸化抑制PD-L1的表达。Western Blot结果显示,糖皮质激素受体在肿瘤细胞上均有表达,并且GR的表达差异与糖皮质激素对PD-L1调控作用的差异不一致,说明肿瘤细胞中GR的表达差异并不是造成糖皮质激素对PD-L1调控作用的差异的原因。进而我们通过q-PCR考察肿瘤细胞中给药后GR下游靶基因的激活水平。结果显示,在H292细胞上分别给予地塞米松(1μM)、安息缩松(1μM)、倍他米松(1μM)后,KLF9的转录水平分别上调7.54±1.11倍(p=0.0005),9.24±1.51倍(p=0.0019)和7.48±3.19倍(p=0.0244),SNAI2的转录水平分别上调3.51±0.44倍(p=0.0006),4.20±0.62倍(p=0.0009)和3.13±1.00倍(p=0.0216),MT2A的转录水平分别上调3.43±0.98倍(p=0.0126),3.59±1.18倍(p=0.0189)和3.60±0.39倍(p=0.0029)。同时,在786-O细胞上给予地塞米松(1μM),KLF9,SNAI2,MT2A三个靶基因分别上调10.48±1.20倍(p=0.0008),4.90±1.12倍(p=0.0070)和1.92±0.55倍(p=0.0498);在A2058上同样以这三个靶基因作为考察指标,结果显示KLF9,SNAI2,MT2A分别上调1.30±0.11倍(p=0.0028),1.79±0.15倍(p=0.0009)和6.69±0.88倍(p=0.0018)。以上结果说明糖皮质激素作用与肿瘤细胞后均可激活GR下游靶基因的表达。于是我们考察了PD-L1的经典转录因子Stat1和IRF1的水平。Western Blot实验发现,在A549细胞的IFNγ诱导模型中给予地塞米松,Stat1 Tyr701磷酸化水平被显著抑制,而Stat1 Ser727的磷酸化水平、Stat1总蛋白水平以及IRF1蛋白水平均无明显变化。不同于A549上的变化,786-O和A2058上p-Stat1 Tyr701,p-Stat1 Ser727以及IRF1的蛋白水平没有被地塞米松抑制。综合上述实验结果,我们发现糖皮质激素可以特异性下调A549细胞上Stat1 Tyr701磷酸化水平从而抑制PD-L1的蛋白水平和转录水平,并且在786-O和A2058上我们没有观察到Stat1Tyr701的磷酸化水平的变化,因此我们初步认为糖皮质激素对肿瘤细胞上PD-L1蛋白调控差异可能是由于地塞米松可以特异性抑制A549细胞上Stat1 Tyr701的磷酸化水平。在小鼠结肠癌MC38细胞上,糖皮质激素抑制其PD-L1的表达,糖皮质激素受体与PD-L1表达呈负相关。在体外采用鼠源性肿瘤细胞考察糖皮质激素对PDL1的调控作用,Western Blot实验显示,在IFNγ诱导模型中,地塞米松可以抑制小鼠结肠癌MC38细胞的PD-L1表达,临床常用的糖皮质激素也可以不同程度下调PD-L1的蛋白水平。在小鼠肺癌LLC细胞中,糖皮质激素可浓度依赖性下调PD-L1的表达水平。在小鼠黑色素瘤B16细胞中,糖皮质激素对PD-L1的表达没有显著性影响。在MC38腋下接种模型和LLC移植瘤模型中,糖皮质激素受体水平与其PD-L1表达程负相关。研究结论:本课题从肿瘤细胞角度出发,揭示了糖皮质激素对不同肿瘤细胞PD-L1表达的影响。在人源非小细胞肺癌中,糖皮质激素可显著抑制PD-L1的表达水平,同样也显著抑制了IFNγ诱导的PD-L1的上调,但在黑色素瘤和肾癌中PD-L1的表达水平无明显变化。在人源非小细胞肺癌中,糖皮质激素可以显著抑制PD-L1的转录水平,但不影响PD-L1蛋白的稳定性。IFNγ作为经典诱导PD-L1上调的细胞因子,主要是通过促进Stat1和IRF1入核从而激活PD-L1的转录。体外细胞模型中我们发现糖皮质激素在非小细胞肺癌中可以特异性下调Stat1 Tyr701的磷酸化水平,并且不影响Stat1 Ser727的磷酸化水平、Stat1总蛋白水平和IRF1的表达水平。另外我们发现糖皮质激素可以抑制小鼠结肠癌MC38细胞和小鼠肺癌LLC细胞中IFNγ引起的PD-L1的上调,在MC38腋下接种模型和LLC移植瘤模型中,我们初步确定了糖皮质激素受体与PD-L1的表达呈负相关,这为我们之后的体内实验提供了前期数据支持。本研究阐述了糖皮质激素对肿瘤细胞上PD-L1表达的影响,为糖皮质激素对免疫治疗疗效的潜在影响提供了理论基础。