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基因表达检测与分析是研究细胞功能的重要手段之一,但传统的分析方法通常是以细胞群体为研究对象,得到的是细胞群体mRNA的整体或平均表达水平,缺少针对单细胞中mRNA定位和定量分析的有效手段。锁式探针滚环扩增(Padlock rolling-circle amplification, Padlock-RCA)原位检测技术是基于锁式探针与单链DNA靶点的特异性结合,连接转换为环形分子后滚环扩增原位检测单链DNA靶点。该技术具有高特异性和高敏感性,能定位和定量分析单细胞内DNA靶点,因此与PCR和传统原位杂交技术相比有明显优势。Padlock-RCA是一系列反应的整合,首先,利用特异的锁核酸(Locked nucleic acid, LNA)与mRNA结合,可在细胞内原位将mRNA反转录成cDNA,通过RNase H将mRNA降解的同时,锁式探针(Padlock probe)与新合成的cDNA中靶序列结合,并通过连接酶的作用,锁式探针自连环化,形成单链环化模板。随后在Phi29聚合酶的作用下,对环化产物进行滚环扩增(RCA),最后荧光探针与扩增产物上的靶序列特异性结合,从而实现对细胞内mRNA的表达水平的检测。Padlock-RCA对组织细胞中含量极低的mRNA有极高的敏感性,能够在单细胞水平检测mRNA的表达,因此可以实现在细胞群体中发现某些基因特异表达的罕见细胞和细胞亚群。本研究的目的就是优化并利用锁式探针滚环扩增方法对小鼠畸胎瘤细胞F9单个细胞中的基因表达进行原位检测。研究主要包括四个部分,首先建立滚环复制扩增的方法,通过对随机引物,Phi29聚合酶,扩增时间等方面的条件摸索,建立了稳定、高效的滚环复制扩增体系；其次,优化锁式探针滚环扩增方法并检测小鼠畸胎瘤细胞F9单细胞中Nanog基因及Perl基因的表达；而后利用维甲酸(RA)诱导小鼠畸胎瘤细胞F9分化模型,对细胞分化前后Nanog基因mRNA表达水平的改变进行分析；最后将F9细胞通过皮下注射,接种到129SV小鼠体内,待成瘤后,将畸胎瘤组织制备冰冻切片,利用Padlock-RCA原位检测小鼠畸胎瘤组织中Nanog基因的表达。本研究成功的应用锁式探针滚环扩增方法检测了Nanog基因和Perl基因在部分F9单细胞中的表达；并发现Nanog基因在F9细胞分化前后表达水平的差异；同时在小鼠畸胎瘤冰冻组织切片中发现大量Nanog基因表达阳性的细胞。为进一步研究单细胞基因表达及细胞亚群功能分析开辟了一条新途径。