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原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs)作为配子的祖先细胞,是生殖细胞发育过程中必不可少的。研究PGCs的发生和分化机理对动物种质资源保存、创新利用以及基因修饰鸡的生产等领域具有重要理论和实践意义。PGCs的发生受到许多因素的影响。目前,研究者们已经发现一些关键性的基因、信号通路、生长因子和表观遗传修饰因素对PGCs的发生起重要调控作用。尽管这些因素对于PGCs形成起到了一定的促进作用,但体外诱导PGCs的生成效率并没有得到提高。因此,亟需从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性地探究,深入了解和认识PGCs的形成过程,以期获取能够满足生产研究所需的大量PGCs细胞。随着测序技术和生物信息分析技术的发展,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在生殖细胞分化与胚胎发育过程中的作用逐渐受到重视。研究lncRNA对PGCs发生的影响及机制,能够为提高PGCs体外生成效率提供新的研究策略。本研究基于前期单细胞高通量测序结果筛选得到鸡PGCs特异表达lncRNA-M1ANCR,利用RNA干扰技术,以家鸡为研究对象,从体内和体外两个水平探究了 lncRNA-M1ANCR在PGCs发生过程中的功能和机制,为有效提高PGCs效率提供理论依据和参考。研究结果如下:(1)lncRNA-M1ANCR的全长扩增,细胞定位与编码能力鉴定:基于前期高通量测序筛选得到PGCs特异性表达lncRNA,命名为lncRNA-M1ANCR,通过RACE实验扩增获得 lncRNA-M1ANCR 全长(共计 1115bp),qRT-PCR 验证了 lncRNA 在 PGCs 中特异性高表达(ESCs:1.021±0.231,PGCs:5.131±1.23,SSCs:1.825±0.828),与转录组测序(ESCs:1.143±0.350,PGCs:37.131±1.053,SSCs:6.825±0.923)结果一致,细胞定位监测发现lncRNA-M1ANCR定位于PGCs细胞质中(细胞核:0.773±0.051,细胞质:3.395±0.583);生物信息学预测发现lncRNA-M1ANCR的4bp-115bp为开放阅读框序列,构建原核融合表达载体发现该序列在BL菌种中不表达蛋白,表明明lncRNA-M1ANCR不存在编码小肽能力。(2)体内外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能:根据lncRNA-M1ANCR全长序列,设计三个shRNA靶位点,连入pGMLV-SC5干扰载体,转染DF-1细胞后通过定量检测发现3号靶位点的干扰效率(67.16%±2.0%)最高且显著高于对照组(P<0.01);同时,克隆lncRNA-M1ANCR全长,构建pcDNA-M1ANCR过表达载体;然后,将lncRNA-M1ANCR慢病毒干扰载体与过表达载体分别转染鸡ESCs,在RA诱导条件下,观察细胞分化形态的变化,结果发现,干扰lncRNA后,类PGCs形成数量(3±1/400×视野)较RA单独诱导组(10±2个/400×视野)和过表达组(12±2个/400×视野)显著减少;进一步采用qRT-PCR检测PGCs细胞特异性标记基因Cvh和C-kit的表达水平发现,干扰组的表达量(CvA:1.029±0.062,C-kit:1.154±0.009)显著低于过表达组(Cvh:1.672±0.123,C-kit:2.232±0.029)和诱导组(CvA:1.232±0.234,C-kit:1.561±0.017)(P<0.01),而全能性基因Nanog的表达(Nanog:1.029±0.024)则显著高于过表达组(Nanog:0.918±0.038)与诱导组(Nanog:0.984±0.033)(P<0.01);间接免疫荧光检测结果表明,干扰组Cvh的表达显著低于RA诱导组和过表达组;流式细胞检测发现,干扰组诱导4d后产生的类PGCs细胞(3.96%±0.32%)显著少于RA诱导组(9.67%±0.24%)和过表达组(12.1%±0.46%)(P<0.01);体内实验中,将干扰载体与过表达载体通过血管注射整合进入鸡胚后,检测生殖标记基因在PGCs的表达情况,发现均出现显著性下降(Cvh:2.631±0.208,C-kit:3.028±0.23)(P<0.01),同时通过石蜡切片观察PGCs细胞在生殖嵴的数量,发现干扰组PGCs的形成明显减少(15±0.57个);为进一步说明lncRNA对PGCs形成的影响,流式细胞分选仪检测干扰lncRNA后PGCs的形成被抑制(4.0%±1.1%),与体外诱导结果一致。结果表明,lncRNA-M1ANCR对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有正向调控作用。(3)lncRNA-M1ANCR启动子核心区域鉴定与转录因子分析:根据RACE结果预测lncRNA-M1ANCR启动子区域并构建真核表达载体p0-EGFP,转染DF-1细胞发现,克隆片段能够稳定表达绿色荧光,确定该区域具有启动子活性;分别构建启动子缺失载体 pGL3-p1-783,pGL3-p2-530,pGL3-p3-269 与 pGL3-p3x 后,转染 DF-1 细胞,进行双荧光素酶报告检测,结果表明,pGL3-p3-269的启动活性最高(4.39±0.35),说明在-269bp～-1bp中存在重要的调控作用元件,对启动子活性具有重要影响。进一步通过生物信息学分析获知,在启动子区域-269bp～-1bp间存在转录因子p53的结合位点,为探究p53对启动子活性是否具有调控作用,本研究构建了 p53的干扰载体与过表达载体。分别转染DF-1细胞后检测缺失片段的双荧光素酶活性,发现干扰p53后核心区域的活性(1.65±0.53)显著低于正常组(4.06±0.41)和过表达组(4.55±0.66)。综上表明,转录因子p53能够调控lncRNA-M1ANCR启动子核心区域的活性,进而调控lncRNA的表达。(4)lncRNA-M1ANCR与gga-mir-1591竞争性结合抑制机制的初步探究:lncRNA具有潜在的ceRNA特性,本研究通过生物信息学分析得到与lncRNA-M1ANCR存在潜在竞争性结合关系的miRNA(gga-mir-1591,gga-mir-3539),分别构建miRNA的模拟物与抑制物,并在RA诱导条件下体外转染鸡ESCs细胞,通过细胞形态观察发现,抑制gga-mir-1591的表达能够促进类PGCs的形成,而模拟gga-mir-1591的表达则干扰类PGCs的形成,gga-mir-3593的模拟物与抑制物对类PGCs的形成无明显作用;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR,MAPK7,全能性基因以及生殖标记基因的表达,发现转染gga-mir-1591抑制物后,MAPK1与lncRNA的表达显著上调(MAPK1:12.293±2.012,lncRNA-M1ANCR:2.137±0.324),生殖标记基因的表达量(Cvh:6.731±0.921,C-kit:6.631±0.918)也显著高于其他组别;为进一步验证gga-mir-1591对鸡PGCs形成的影响,本研究通过流式分析检测发现,抑制gga-mir-1591后,类PGCs的阳性细胞率(3.13±0.22%)显著高于其他组别(P<0.01),表明miRNA gga-mir-1591对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有调控作用,与lncRNA-M1ANCR可能存在竞争性结合抑制关系。为进一步验证gga-mir-1591与lncRNA-M1ANCR之间的关系,本研究在转染gga-mir-1591模拟物与抑制物的基础上,分别转染了 lncRNA-M1ANCR的过表达载体与干扰载体,通过拯救实验来验证两者之间存在的竞争性结合抑制关系。细胞形态学观察结果发现,抑制gga-mir-1591 后类 PGCs 的形成能够受 lncRNA 干扰载体的影响,导致类 PGCs 形成减少,反之亦然;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR,MAPK1,全能性基因以及生殖标记基因的表达发现,在抑制gga-mir-1591表达同时干扰lncRNA情况下,MAPK1的表达量较抑制gga-mir-1591组显著降低(P<0.01),生殖标记基因的表达也有显著下降(P<0.05);综上表明,gga-mir-1591 与 lncRNA-M1ANCR 存在竞争性结合关系,lncRNA-M1ANCR 通过“海绵样”吸附的方式,竞争性结合靶向作用于 MAPK1 的 miRNA gga-mir-1591,调控MAPK1的表达水平,进而调控鸡PGCs的形成。(5)lncRNA-M1ANCR互作蛋白的筛选与鉴定:通过对lncRNA-M1ANCR的RNA pull down结果分析得到,在鸡ESCs向PGCs分化过程中lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白存在潜在相互作用关系,为进一步验证两者之间的作用机制,本研究通过Western Blot实验确定了 ILF3蛋白在鸡PGCs中存在表达,并通过RIP实验发现,ILF3与lncRNA间存在结合。为了进一步探究两者之间的互作关系,本研究对与ILF3与lncRNA相关的下游信号通路的关键节点基因进行了 qRT-PCR检测,结果表明干扰lncRNA后,下游信号通路关键基因MAPK与Wnt(MAPK:10.342±1.192,Wnt:6.323±0.624)较过表达组(MAPK:14.432±1.394,Wnt:10.960±0.934)显著降低。综上表明,在鸡PGC的形成过程中,lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白间存在互作关系,并且lncRNA表达的变化能够影响下游信号通路关键基因的表达。