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神经内分泌系统对机体免疫功能具有重要的调控作用。经典神经递质、神经肽是直接作用于免疫活性细胞和其他参与免疫反应细胞的重要调节物质。P物质(Substance P,SP)是发现最早的神经肽之一,属于哺乳动物速激肽家族。中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞是SP的主要来源,免疫细胞是SP的另一来源。外周神经末梢释放SP参与免疫调节和炎症过程,免疫细胞产生SP以自分泌或/和旁分泌的方式调节免疫细胞的功能。SP可从多方面影响各种免疫细胞,且SP在不同条件下所起的作用具有复杂性和多样性。SP可以影响淋巴细胞的增殖、分化,诱导免疫球蛋白和细胞因子的合成,并能够调节Th细胞的活性和其他一些免疫细胞的活性,通过以上作用参与调节机体的细胞免疫和体液免疫。SP是通过与速激肽受体(TK-R)的亚型NK-1(neuorkinin-1),NK-2,NK-3受体的结合来发挥其生物学活性的,其中SP与NK-1R的亲和力最高,对NK-2R和NK-3R有较低的亲和力,既SP发挥生理作用的主要途径是NK-1受体。SP受体分布于神经细胞、内皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等多种细胞。在免疫系统,SP受体几乎分布于各种免疫细胞,包括T、B淋巴细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、中性粒细胞和肥大细胞等。
自然杀伤细胞(Natural killer cells)参与免疫系统的发生、发展及效应等重要环节的调节过程,是机体天然免疫的主要承担者,也是获得性免疫的核心调节细胞,NK细胞无需特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。NK细胞杀伤靶细胞主要是通过与靶细胞直接接触,分泌杀伤介质穿孔素、颗粒酶、TNF和NK细胞毒因子(LT)等导致靶细胞死亡。另一方面,NK细胞还可分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、LT、IL-8和IL-5等有免疫调节作用的细胞因子来间接杀伤靶细胞。NK细胞功能的发挥主要依赖于NK细胞能表达多种与主要组织相容性抗原(MHC)和非MHC类配体结合的受体,传递抑制和激活信号,NK细胞的杀伤活性取决于激活信号与抑制信号的平衡。目前发现的NK细胞表面的活化性受体包括自然细胞毒受体(Natural cytotoxicity receptors,NCRs)、NKG2D、活化杀伤免疫球蛋白样受体(Killer immunogloblin-like receptors,KIRs)及其他辅助刺激活化性受体2B4、DNAM-1、NTB-A、CD59等。
目前,有关SP对NK细胞生物学功能的调控及作用机制的研究,国内外尚少见报道。已有一些研究证据表明SP对NK细胞的调节作用,但其作用机制尚不十分清楚。本研究以非IL-2依赖的NK92-MI细胞株为研究体系,首先研究了SP对NK92-MI细胞增殖活性和杀伤活性等功能的影响,并分析了杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达和释放与SP增强NK92-MI细胞杀伤活性的关系。其次研究了SP对NK92-MI细胞活化性受体NCRs表达的影响,进一步阐明SP对NK92-MI细胞功能的调控作用及内在作用机制。最后我研究了SP受体(NK-1R、2R、3R)在NK92-MI细胞上的组成性表达,以及SP对NK92-MI细胞NK-1R、2R、3R表达的影响,并检测了SP作用于NK-92MI细胞后其胞浆Ca2+浓度的变化,探讨SP调控NK92-MI细胞功能的受体途径和信号转导通路。以揭示SP对NK细胞生物学活性调控作用的机制。
材料和方法：
1.细胞培养：NK92-MI细胞株为非IL-2依赖性NK92细胞株(NK92细胞来自一个进行性非霍奇金淋巴瘤患者,1998年建系),购自中科院上海细胞库；用含12.5％胎牛血清和12.5％马血清的α-MEM培养基(不含RNA和DNA)传代培养。
2.MTT法测定SP对NK92-MI细胞增殖活性的影响。
3.MTT法测定SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响。
4.RT-PCR测定NK92-MI细胞NK-1R、2R、3R的组成性表达。
5.Real-Time PCR法测定SP对NK92-MI细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)、NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)以及SP受体(NK-1R、2R和3R)的mRNA表达的影响。
6.Western-Blot法测定SP对NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达的影响。
7.β-己糖胺酶释放实验测定sP对NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B释放的影响。
8.流式细胞术检测SP对NK92-MI细胞NKp44、NKp46、NKp30分子和NK-1R的膜表达的影响。
9.Fura-2/AM荧光探针法测定NK92-MI细胞胞浆Ca2+浓度。
10.统计学分析所得实验数据均以均数±标准差(x±SD)表示,各组间均数比较采用一维方差分析(one-way.ANOVA),p＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
一、SP对NK92-MI细胞的促增殖作用经一定浓度(10-14～10-6M)的SP作用24h后,NK92-MI细胞的增殖无明显变化,作用48h后,10-12～lO-6M的SP对NK92-MI细胞的增殖均有明显促进作用。
二、SP对NK92-MI细胞杀伤活性的增强作用一定浓度(10-14～10-6M)的SP作用24h,除较高浓度10-6M外,10-14～10-8M的SP对NK92-MI细胞的杀伤活性均显示有明显增强作用。
三、SP对NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B表达的影响
1.SP增加NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(10-14～10-10M)的sP作用NK92-MI细胞24h,各浓度的SP均可显著提高NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达水平。
2.SP增加NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP作用NK92-MI细胞24h,各浓度SP均可增加NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达,仅10-14M的SP对穿孔素的表达无明显作用。
四、SP对NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B释放的影响选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP作用NK92-MI细胞24h后,NK92-MI细胞的β-己糖胺酶释放无明显变化,表明SP对穿孔素和颗粒酶的释放无明显影响。
五、SP对NK92-MI细胞活化性受体NCRs(NKp44、NKp46、NKp30)表达的影响
1.SP增加NK92-MI细胞活化性受体NCRs(NKp44、NKp46、NKp30)的mRNA表达选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP作用NK92-MI细胞24h,各浓度的SP均可显著增加NK92-MI细胞NCRs的mRNA表达。
2.SP对NK92-MI细胞NCRs膜表达的作用选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP处理NK92-MI细胞24h,各浓度的SP均可增加NKp46的膜表达;仅较低浓度(10-14M)的SP对NKp44的膜表达有增加作用;各浓度的SP对NKp30的膜表达均无明显作用。
六、NK-1R在NK92-MI细胞上的功能性表达
1.SP诱导NK92-MI细胞NK-1R的mRNA表达及膜表达增加一定浓度(10-14～10-6M)的SP作用NK92-MI细胞1、4和24h后,各浓度SP作用较短时间(4h)即可增加NK92-MI细胞NK-1R的mRNA表达。SP作用NK92-MI细胞24h后,10-14～10-8M的SP均能明显增加NK92-MI细胞NK-1R的膜表达。
2.NK-1R特异性拮抗剂对SP调控NK92-MI细胞功能的阻断作用使用NK-1R特异性拮抗剂可完全阻断SP对NK92-MI细胞增殖活性的促进作用;大部分阻断SP对NK92-MI细胞杀伤活性的增强作用;大部分阻断SP对NK92-MI细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的mRNA表达的增加作用。
七、SP诱导NK92-MI细胞NK-2R、3R的mRNA表达增加NK92-MI细胞组成性表达NK-2R、3R。SP作用1、4、24h后,可诱导NK92-MI细胞NK-2R、3R的mRNA表达增加,NK-2R的mRNA表达在4h时开始增加,24h时达到最高;NK-3R的mRNA表达趋势与NK-1R相似,在4h时表达最高。
八、SP提高NK92-MI细胞胞浆游离Ca2+的浓度一定浓度(10-14～10-6M)的SP作用NK92-MI细胞1h后,NK92-MI细胞胞浆Ca2+的浓度明显增高。
结论：
1.10-14～10-6M浓度范围的神经肽SP对NK92-MI细胞的增殖活性和杀伤活性有促进作用。
2.所观察浓度范围的SP可增加NK92-MI细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的mRNA表达及蛋白表达;SP对NK92-MI细胞杀伤活性的增强作用,是通过直接增加其杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达来实现的。
3.所观察浓度范围的SP可诱导NK92-MI细胞中NCRs(主要是NKp46分子)的表达增加,说明SP可以作为一种活化因子来调节NK92-MI细胞的功能;且SP可以通过增加活化性受体的表达来间接调节NK92-MI细胞的杀伤活性。
4.NK92-MI细胞组成性表达NK-IR、2R、3R;SP通过与其受体NK-1R的正反馈机制来调节NK92-MI细胞功能;SP对NK92-MI细胞功能的调控,可能有NK-1R、2R、3R几种受体的协同或交叉作用。
5.SP激活NK92-MI细胞上NK-1R后,部分信号转导是以Ca2+为第二信使;肌醇三磷酸(IP3)途径和环磷酸腺苷(cAMP)依赖的PAK途径都可能参与了SP通过NK-1R调节NK92-MI细胞功能的信号转导。