金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子量、高Cys含量、具有金属结合能力的多肽，最早在蓄积镉的马肾组织中发现，而在植物中分离的与动物MT同源的蛋白被称为植物类金属硫蛋白(Metallothionein Like，MT-L)。根据Cys的位置与排列方式，植物类金属硫蛋白被分为三类。Ⅰ类与Ⅱ类MT的最大区别在于前者的Cys集中分布在肽链的N端和C端，中间由一段不含Cys的间隔区相连，后者的Cys则散布在整个肽链中；而第Ⅲ类MT为非基因编码产物，是以谷胱甘肽为底物酶促合成的多聚物。目前对植物类金属硫蛋白的结构与功能的研究还不够深入，普遍认为其与金属结合有关。　　 黄瓜类金属硫蛋白2(CsMT-L2)基因由本实验室在黄瓜果实cDNA文库分析中得到鉴别和克隆，其功能尚未得到研究。本研究将该基因在原核中表达，分析其表达的蛋白对金属离子的螯合能力，并与人的金属硫蛋白的β结构域和类植物螯合肽相比较；同时，将CsMT-L2的两个富含Cys的区域直接相连，构成中间连接区缺失突变体CsMT-L2m，探讨该蛋白中间连接区的功能。该研究将为深入揭示金属硫蛋白的结构与功能的关系提供理论依据，阐明Ⅰ类植物类金属硫蛋白的中间连接区的作用，为该基因的应用研究奠定基础。主要结果如下：　　 1.成功构建4个相关原核表达载体。　　 利用高保真PrimStar HS DNA聚合酶，通过PCR扩增得到4个相关基因，分别连接到pET32a+原核表达载体多克隆位点区域，经过酶切、测序验证，4个基因成功插入载体中并且可读框正确。　　 2.CsMT-L2、CsMT-L2m、HsMT-L2和PcL等4个融合蛋白在原核表达中得到了大量表达。　　 四个融合蛋白经过原核表达、MagneHisTM蛋白纯化系统纯化、SDS-PAGE电泳检测、S-TagWestern Blot，均得到了预期大小的目的条带。　　 3.证实了4种融合蛋白在大肠杆菌体内具有金属螯合能力。　　 通过火焰原子光谱法测定结合Zn2+、Cd2+金属含量，CsMT-L2、CsMT-L2m、PcL、HsMTb融合蛋白在菌体内吸附Zn2+能力分别为1.37×10-5mol/g、0.693×10-5mol/g、0.948×10-5 mol/g、0.911×10-5mol/g，而CsMT-L2、CsMT-L2m、HsMTb、PcL融合蛋白在菌体内吸附Cd2+能力分别为1.25×10-4 mol/g、3.43×10-5mol/g、1.15×10-5 mol/g、7.67×10-5 mol/g，均明显高于对照组(p＜0.01)，说明四种蛋白都具有金属结合的能力，但是四个相关蛋白金属结合能力是有明显的差异，其中CsMT-L2结合Zn2+、Cd2+能力最强，PcL次之，可能与结构有关。其中，改造的金属硫蛋白(CsMT-L2m)金属结合能力明显下降(尤其Cd2+的影响较大)，说明中间连接区对于两个富含Cys区域之间的协调以及整个构象正确折叠发挥重要的作用。　　 4.明确了蛋白CsMT-L2与CsMT-L2m的信号肽、跨膜区、磷酸化位点和高级结构。　　 运用生物信息学的方法和软件对其信号肽、跨膜区、磷酸化位点、二、三级结构、分子进化关系等重要参数进行预测和推断。结果表明：CsMT-L2与CsMT-L2m为无信号肽蛋白，非分泌、非跨膜蛋白，CsMT-L2包含三个磷酸化位点，CsMT-L2没有磷酸化位点，CsMT-L2的二级结构由Alpha helix(Hh)、Extended strand(Ee)、Random coil(Cc)三种形式构成，其中Alphahelix(Hh)占11.84％、Extended strand(Ee)占9.21％、Random coil(Cc)占78.95％。CsMT-L2m的二级结构全部是无规则卷曲。CsMT-L2的三维模型符合hairpin模型。