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金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,真菌杀虫剂尽管安全,无环境污染,但存在着杀虫速率缓慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。对昆虫病原真菌致病机制进行研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。海藻糖是一种非还原性二糖,存在于所有已知种类的昆虫中,是昆虫血淋巴中主要的糖类(大约占80-90%)。海藻糖在昆虫血液生理中起着重要的作用,其耗竭可能对昆虫起着致命性的作用。虫生真菌侵染进入昆虫血腔后,昆虫血淋巴中的海藻糖成为真菌生长主要的营养物质。但海藻糖对许多真菌来说是非渗透性二糖,必须在相应的二糖水解酶作用下分解为葡萄糖才能被真菌利用。金龟子绿僵菌侵染进入昆虫血淋巴后,能分泌酸性海藻糖酶,有效地降解昆虫血淋巴中的海藻糖。因此酸性海藻糖酶在真菌对昆虫的致病过程中起着重要的作用。目前对真菌酸性海藻糖酶的研究较少,只有少数几个物种的酸性海藻糖酶基因被克隆并测定序列。在虫生真菌中,除了本实验室报道已纯化出金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶和获得该基因序列,还未见其他酸性海藻糖酶方面的报道。但是绿僵菌天然酸性海藻糖酶表达量少、不稳定、纯化步骤繁琐、成本高,不利于进一步研究酸性海藻糖酶。本研究以金龟子绿僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa102为研究材料,结合RACE等技术手段,成功分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因全序列并登录NCBI的GenBank,登录号为:EF190950 (cDNA序列)。同时在毕赤酵母中成功表达绿僵菌酸性海藻糖酶,并与绿僵菌天然的酸性海藻糖酶进行酶学特性比较。此外,根据该基因序列构建了绿僵菌酸性海藻糖酶RNA干扰载体,获得3个RNAi转化子。研究结果为进一步利用基因工程手段改造病原真菌、提高生物防治效果奠定了基础。主要研究结果如下:1.利用已知片段,结合RACE等技术手段分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因,其GenBank登录号为EF190950(cDNA序列)。酸性海藻糖酶(ATM1)DNA序列含有3个内含子,其开放阅读框(ORF)编码一个含1073个氨基酸的蛋白质,该酸性海藻糖酶具有一个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点( Asn-Xaa-Ser/ Thr )。NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillus fumigatus的alpha,alpha- trehalose glucohydrolase,Aspergillus nidulans的酸性海藻糖酶前体和Talaromyces emrsonii的酸性海藻糖酶分别有62%、59%和57%的氨基酸相似性;同时与另外两个真菌Saccharomyces cerevisiae (Ath1p)和Candida albicans (Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25%的氨基酸相似性。2.构建重组表达毕赤酵母菌株KM71/ATM1,并筛选出高效表达CQMa102酸性海藻糖酶的毕赤酵母菌株KM71/ATM1(pPATM1-21)。在0.5%甲醇诱导48个小时后,pPATM1-21菌株分泌酸性海藻糖酶达到最高峰5.35 units/mg protein (352 units/liter)。利用PCR技术,在构建表达载体pPIC9K-ATM1时,在ATM1序列的C-端引入组氨酸标签,一步Ni亲和层析纯化出酸性海藻糖酶(reATM1p)。3.ReATM1p酶学特性分析:该蛋白为糖蛋白,等电点4.9,分子量170KDa;Trehazolin是其特异性抑制剂,其IC50为1.9×10-8M;海藻糖为该蛋白专一性底物,其最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0;该酸性海藻糖酶特征米式常数(Km)为2.6mM,最大酶促反应速度(Vmax)为0.305 mmol min-1 mg -1 protein。4.根据ATM1基因序列构建了金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶的RNA干扰载体,利用基因枪法,转化金龟子绿僵菌CQMa102,经过PCR筛选和Southern blot验证,获得3个RNAi转化子。3个RNA干扰菌株(RA14,RA42和RA74)ATM1的mRNA转录水平比野生型的分别下降了98.84%, 98.57%和96.56%。