滚环扩增阳离子共轭聚合物均相检测microRNA

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microRNA(miRNA)是一种长度一般在20-24个核苷酸左右的非编码小分子RNA,它在基因调控和表达中起着重要作用。由于它在生物个体发育分化等生命活动中有着重要调节作用,因此对miRNA的检测在研究生物功能和临床诊断等方面具有重要意义。本论文应用滚环扩增技术结合阳离子共轭聚合物均相检测,提出了一种在均相溶液中进行microRNA检测的新方法。设计的锁式探针(PLP)与目标分子miRNA-221两侧序列完全互补,然后在T4RNA连接酶2的作用下,PLP探针首尾相接被连接成环。随后目标分子miRNA-221可直接作为引物,以环形PLP探针为模板在Phi29DNA聚合酶作用下引发滚环扩增反应,生成上万个碱基的DNA单链产物。随后在扩增产物中加入与其互补的荧光标记探针,并使其充分杂交。未杂交的荧光标记探针应用核酸外切酶I降解为单核苷酸分子。当加入阳离子共轭聚合物时,由于阳离子共轭聚合物和DNA链之间很强的静电吸引作用,在二者之间会产生高效率的荧光共振能量转移(FRET)。通过测量共轭聚合物荧光发射强度的变化,在均相溶液中实现了microRNA检测。该方法对于miRNA-221检测的线性范围为0.5-20pmol/L,检测限为0.2pmol/L。
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