论文部分内容阅读
乳腺炎是制约世界奶牛养殖业发展的最重要疾病之一。奶牛乳腺炎的病原微生物种类繁多,但以葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主,其中金黄色葡萄球菌是接触传染性病原菌,而且具有公共卫生意义；凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci, CNS)有20多种,已成为许多国家奶牛乳腺炎的主要病原菌,但不同国家流行的CNS种类不同。葡萄球菌毒力基因多达数十种,但具体的致病作用知之甚少。奶牛乳腺炎主要靠加强饲养管理和使用抗菌药物进行控制,但随着抗生素的长期、盲目使用,细菌耐药现象日益严重。国内对奶牛乳腺炎葡萄球菌的系统研究较少,本研究对乳腺炎葡萄球菌的种类、毒力基因、抗性基因及其与耐药表型的关系进行了系统的调查分析,旨在为奶牛乳腺炎葡萄球菌致病与耐药机制的深入研究奠定基础。一、奶牛乳腺炎葡萄球菌的分离与种类鉴定根据临床检查和乳汁体细胞检测结果,在2012年6月到2014年6月期间采集乳腺炎阳性奶样209份,接种血琼脂平板培养后挑取疑似菌落,根据菌落形态和革兰氏染色镜检结果,筛选到104份葡萄球菌感染阳性奶样。在分离的104株葡萄球菌中,所有菌株均为过氧化氢酶试验阳性,29株(27.9%)为耐热核酸酶试验阳性,27株(26.0%)为凝固酶试验阳性,24株(23.1%)为耐热核酸酶基因检测阳性,28株(26.9%)为凝固酶基因检测阳性。综合上述结果,将28株(26.9%)初步鉴定为金黄色葡萄球菌,76株(73.1%)鉴定为CNS。用PCR扩增葡萄球菌蛋白翻译Tu延伸因子(elongation Tu factor, Tuf)和16SrRNA基因片段并进行序列测定,以同源性≥98%为种的区分标准,将28株确认为金黄色葡萄球菌,76株CNS分为13个种,其中阿尔莱特葡萄球菌(S. arlettae)、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、木糖葡萄球菌(S. xylosus)和产色葡萄球菌(S. chromogenes)为优势CNS,分别占15.8%；表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、模仿葡萄球菌(S. simulans)、马胃葡萄球菌(S. equorum)、溶血性葡萄球菌(S. haemolyticus)和沃氏葡萄球菌(S. warneri)次之,猪葡萄球菌(S. hyicus)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)、琥珀葡萄球菌(S. succinus)和苍蝇葡萄球菌(S. muscae)为次要CNS,各占1.3%。这些研究结果表明,葡萄球菌是该场奶牛乳腺炎的主要病原菌,并以CNS为主,但优势CNS种类不同于国外报道；Tuf基因序列分析可用于葡萄球菌种的鉴定,但少数菌株需用16S rRNA基因序列予以确认。二、奶牛乳腺炎葡萄球菌毒力基因的检测与分析将37个葡萄球菌毒力基因分为普通毒力基因、外毒素基因和生物被膜形成基因。以葡萄球菌基因组DNA为模板进行单一、双重或多重PCR检测,结果在28株金黄色葡萄球菌中,14个普通毒力基因的检出率依次为凝固酶基因coa和免疫球蛋白结合蛋白基因坦(100%)、溶血素A基因hla(96.4%)、溶血素B基因hlb和纤维蛋白原结合蛋白基因∥b(92.9%)、凝集因子A基因clfA(89.3%)、凝集因子B基因clfB和耐热核酸酶基因聆uc(85.7%)、MHC Ⅱ类分子类似物蛋白基因map(78.6%)、荚膜多糖5基因cap5(46.4%)、荚膜多糖8基因cap8和弹性蛋白结合蛋白基因e助(39.3%)以及胶原结合蛋白基因cnα(10.7%)；12个外毒素基因的检出率依次为肠毒素G基因seg(14.3%)、肠毒素I基因sei(10.7%)和肠毒素A基因sea(7.1%)；11个生物被膜形成基因的检出率依次为层粘连蛋白结合蛋白基因etno(100%)、葡萄球菌蛋白A基因spa(96.4%)、纤连蛋白结合蛋白B基因fnbB(75.0%)、细胞粘附D基因icaD(71.4%)、附属调节1基因agr-1(64.3%)和附属调节2基因agr-2(17.9%)。这些毒力基因以19个不同的基因组合存在,但仅1个为优势毒力基因组合(32.1%)。在76株CNS中,普通毒力基因的检出率依次为国(18.4%)、map(11.8%)和cap8(1.3%),外毒素基因的检出率依次为sei(5.3%)和seb(2.6%),生物被膜形成基因的检出率依次为eno(53.9%)、bap(10.5%)、agr-2(3.9%)、fnbA(2.6%)和fnbB(2.6%),其毒力基因组合不仅数量少,而且非常简单。多数金黄色葡萄球菌均携带溶血素A基因,提示对奶牛乳腺的致病性较强。所有葡萄球菌的外毒素和生物被膜基因检出率均显著低于国外报道,提示其相关致病机制的复杂性。三、奶牛乳腺炎葡萄球菌抗性基因检测及其与耐药性的关系分析以葡萄球菌基因组DNA为模板,用单一、双重或多重PCR检测甲氧西林抗性基因mecA,氨基糖苷类抗性基因aacA-aphD.aac(6’)laph(2")、aph(3’)-Ⅲa和ant(4’)-Ia,链阳霉素A抗性基因vatA、vatB和vatC,红霉素与克林霉素抗性基因ermA.ermB和ermC,四环素抗性基因tetK和tetM,大环内酯类抗性基因msrA和msrB,林可酰胺类抗性基因linA,以及青霉素抗性基因blaZ。结果在28株金黄色葡萄球菌中,17种抗性基因的检出率依次为blaZ(82.1%)、 mecA(35.7%)、aacA-aphD(32.1%)、aac(6’)/aph(2")(28.6%)、tetK(10.7%)、ermC(7.1%)和linA(7.1%),多数菌株携带多个抗性基因组合且含blaZ基因。在76株CNS中,抗性基因的检出率依次为linA(38.2%)、tetK(34.2%)、blaZ(30.3%)、aacA-aphD(21.1%)、msrB (19.7%)、mecA和msrA(17.1%)、ermC(13.2%)、aac(6’)/aph(2")(10.5%)、ermB(9.2%)和tetM(2.6%),mecA基因主要见于松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌,多数菌株携带多个抗性基因组合,其中表皮葡萄球菌的抗性基因组合最多。药敏试验分析结果显示在28株金黄色葡萄球菌中,100%对两种或以上抗生素耐药；82.1%对青霉素耐药,与blaZ因密切相关；46.4%对链霉素耐药,与aacA-aphD、aac(6’)/aph(2")或未知基因相关；35.7%对卡那霉素和妥布霉素耐药,32.1%对庆大霉素耐药,与aacA-aphD或aac(6’)/aph(2")基因相关；32.1%对头孢西丁耐药,主要与blaZ和mecA基因相关；14.3%对红霉素耐药,与ermC.或未知基因相关；10.7%对四环素耐药,与tetK或未知基因相关。在76株CNS中,79.4%对两种或以上抗生素耐药；86.8%对青霉素耐药,与blaZ或未知基因相关；48.7%对红霉素耐药,与erm、msr或未知基因相关：46.1%对链霉素耐药,27.6%对卡那霉素耐药,13.2%对庆大霉素耐药,11.8%对妥布霉素耐药,与aacA-aphD、aac(6’)/aph(2")或未知基因相关；39.5%对四环素耐药,与tetK基因密切相关；30.3%对克林霉素耐药,与ermB、ermC、linA或未知基因相关；27.6%对头孢西丁耐药,与mecA、blaZ或未知基因相关。这些研究结果表明,本研究的葡萄球菌blaZ和mecA基因检出率均显著高于国内外报道,可能与该奶牛场长期使用青霉素进行乳腺炎防治和场内耐药菌株循环传播有关。部分抗生素抗性与未知基因相关,提示葡萄球菌耐药机制的复杂性。