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研究背景Syndecan-4(Synd4)是细胞表面普遍存在的硫酸肝素样糖蛋白(heparin sulfate proteoglycan,HSPG)受体,可以与多种生长因子相互作用,介导细胞内信号传导通路变化,参与多个生理、病理过程,包括引导细胞迁移。血管新生障碍是糖尿病常见并发症之一,我们推测可能与糖尿病时内皮细胞表面Synd4受体介导的细胞通路受损相关。本实验目的即:1、观察糖尿病时是否存在血管内皮细胞表面Synd4脱落的现象;2、研究Synd4缺失是否会造成血管新生障碍;3、探讨Synd4缺失造成血管新生障碍的机制;4、研究高表达内皮细胞的Synd4是否可以逆转糖尿病血管新生障碍。研究方法1、在人、动物、细胞三个层面研究糖尿病时是否存在内皮细胞表面Synd4脱落的现象,并在细胞水平简单探讨其机制。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测50名2型糖尿病患者和50名性别、年龄相匹配的健康人血浆中Synd4的浓度;大剂量链脲酶菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射诱导大鼠糖尿病模型,每周取血,ELISA方法检测大鼠血浆中Synd4的浓度随时间的变化规律,大鼠成模14周后处死,取主动脉进行免疫组化染色,评价大鼠主动脉内皮细胞膜上Synd4的密度;利用晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),用 Westen Blotting 的方法检测内皮细胞表面 Synd4的表达水平。2、利用体外和体内实验研究Synd4缺失对血管新生的影响。引进Synd-/-小鼠,对比db/db小鼠、Synd4-/-小鼠、野生型(wild type,WT)小鼠主动脉血管新生能力;建立基质胶小室模型(matrigel plug),评价上述各组小鼠组织血管新生情况。3、研究Synd4缺失对细胞迁移的影响。制备Synd4干扰慢病毒(Lenti-Synd4-RNAi),转染HUVEC,建立稳定细胞株,利用细胞划线实验,检测Synd4低表达HUVEC迁移情况;利用μ-slide 2D建立胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)浓度梯度,在活细胞工作站下观察Synd4低表达HUVEC沿生长因子浓度梯度迁移的情况。4、制备Synd4重组腺病毒,研究Synd4高表达是否可以逆转糖尿病血管新生障碍。利用Synd4腺病毒转染db/db小鼠、通过主动脉环出芽模型和基质胶小室模型,分别评价高表达Synd4对糖尿病血管新生障碍的改善情况。研究结果1、糖尿病患者血浆中Synd4浓度低于对照组(p<0.05);糖尿病大鼠血浆中Synd4的浓度随着成模时间逐渐减低,成模13周时糖尿病大鼠血浆中Synd4浓度低于对照组(p<0.05),成模14周时糖尿病大鼠主动脉内皮细胞膜的Synd4浓度低于对照组;AGEs刺激HUVEC,能通过RAGE引起细胞内氧化应激增加,导致细胞膜上的Synd4发生脱落。2、db/db小鼠、Synd4-/-小鼠动脉环的血管新生低于WT小鼠(p<0.05),基质胶小室内血管新生低于WT小鼠(p<0.05)。3、在细胞划线实验中,Synd4低表达HUVEC存在迁移障碍;利用活细胞工作站观察HUVEC,亦见Synd4低表达和AGEs刺激均可以显著损害HUVEC细胞的迁移能力。4、予db/db小鼠主动脉环高表达Synd4,可以逆转db/db小鼠主动脉出芽障碍,在基质胶内预混Synd4腺病毒,可以增加基质胶内的新生血管。研究结论我们发现糖尿病时存在血管内皮细胞表面Synd4脱落的现象,Synd4的脱落可以导致血管新生障碍,机制可能是影响了内皮细胞的迁移功能,高表达内皮细胞的Synd4可以逆转糖尿病时的血管新生障碍。