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第一部分剔除TASK离子通道改变七氟烷对小鼠应激反应的抑制作用目的:建立手术应激模型,检测敲除TASK离子通道是否影响七氟烷对手术应激的抑制。方法:选取野生型小鼠和TASK-KO型(四川大学华西医院)C57BL/6成年小鼠各32只(雄性),共64只,年龄8-10周,体重18-25g。采用数字随机表法将野生型和TASK-KO型小鼠分别随机分成4组,共8组,每组8只(n=8)。野生型分为4组:空白组(C1)、七氟烷组(S1)、手术组(O1)、手术+七氟烷组(H1);基因敲除型分为4组:空白组(C2)、七氟烷组(S2)、手术组(02),手术+七氟烷组(H2)。术前小鼠均经腹腔注射1%戊巴比妥钠100mg/kg;待小鼠麻醉后,空白组不做处理,S1和S2组麻醉后单纯七氟烷吸入(2.5%,氧流量2L/min)10min,O1和O2组麻醉后建立改良性剖腹探查手术应激模型(10min完成),H1和H2组在建立改良性剖腹探查模型同时行七氟烷吸入(2.5%,氧流量2L/min)10min。各组处理完后,在相同的时间点分别检测小鼠血压、心率(IITC无创血压仪)及血糖(快速血糖仪)。结果:野生组与。TASK-KO组中,手术后小鼠血压、心率及血糖与对照组相比显著上升(P<0.05);七氟烷吸入后小鼠血压、心率与空白组相比显著下降(P<0.05),血糖仅在野生小鼠中出现显著下降(P<0.05);在手术过程中吸入七氟烷,小鼠血压、心率与对照组相比显著下降(P<0.05),血糖仅在TASK-KO小鼠中出现显著下降(P<0.05)。TASK离子通道敲除后,未改变基础麻醉后的血压、心率及血糖,其他各组小鼠与野生组相比,血压、心率均高于野生型小鼠(P<0.05)。结论:七氟烷能抑制野生型小鼠手术应激反应,而对TASK-KO小鼠的手术应激反应的抑制作用减弱。第二部分肾上腺TASK离子通道参与七氟烷抑制手术应激反应目的:探讨七氟烷抑制手术过程中的应激反应是否与肾上腺TASK离子通道有关。方法:分别选取野生型小鼠和TASK-KO基因敲除型(四川大学华西医院)C57BL/6成年小鼠各32只(雄性),共64只,年龄8-10周,体重18--25g。采用数字随机表法将野生型和基因敲除型小鼠分别随机分成4组,共8组,每组8只(n=8)。野生型分为4组:空白组(C1)、七氟烷组(S1)、手术组(01)、手术+七氟烷组(H1);基因敲除型分为4组:空白组(C2)、七氟烷组(S2)、手术组(O2),手术+七氟烷组(H2)。术前小鼠均经腹腔注射1%戊巴比妥钠100mg/kg;空白组不做处理;S1和S2组麻醉后单纯七氟烷吸入(2.5%,氧流量2L/min)10min,O1和O2组麻醉后建立改良性剖腹探查手术应激模型(10min完成),H1和H2组在建立改良性剖腹探查模型同时行七氟烷吸入(2.5%,氧流量2L/min)10min;操作结束后在相同时间点取小鼠眼球血及下丘脑、肾上腺组织,利用PCR和蛋白免疫印迹法检测TASK-1、TASK-3离子通道分别在野生型和TASK-KO基因敲除型小鼠下丘脑及肾上腺DNA及蛋白质表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)及血清皮质酮(CORT)浓度;采用高效液相色谱法(HPLC)测定血清中肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)浓度。结果:根据PCR和蛋白免疫印迹(WesternBlot)结果显示出,野生型小鼠下丘脑、肾上腺组织中有TASK-1、TASK-3离子通道表达,而在TASK-KO小鼠下丘脑、肾上腺组织中TASK-1、TASK-3离子通道表达微弱。野生组及TASK-KO中,手术后CRH、ACTH、血浆儿茶酚胺含量及血浆皮质酮含量上升(P<0.05);七氟烷暴露后,小鼠CRH、ACTH、血浆儿茶酚胺含量及血浆皮质酮含量显著下降(P<0.05)。TASK-KO小鼠各组与野生组相比,CRH和ACTH含量没有显著差异(P>0.05),血浆儿茶酚胺含量及血浆皮质酮含量均高于野生型小鼠(P<0.05)。结论:七氟烷抑制小鼠手术应激是通过肾上腺TASK离子通道介导的。第三部分七氟烷通过激活肾上腺TASK离子通道抑制手术应激目的:研究七氟烷对小鼠TASK通道电流及细胞兴奋性的影响,并进一步探讨其抑制手术应激的作用机制。方法:分别选取野生型小鼠和TASK-KO基因敲除型(四川大学华西医院)C57BL/6成年小鼠各8只(雄性),共16只,年龄8-10周,制备肾上腺切片,采用全细胞膜片钳技术,记录静息状态下肾上腺细胞膜电压;记录pH5.9及pH7.3时,肾上腺细胞的TASK离子通道特征性电流;记录七氟烷对小鼠肾上腺片细胞TASK离子通道电流以及兴奋性的影响,探讨此调节作用在七氟烷对手术应激中的相应机制。结果:静息状态下,野生小鼠肾上腺皮质细胞电压为-74.3±4.71mV,TASK-KO小鼠中为-54.8±3.65mV,野生小鼠肾上腺髓质细胞电压为-68.9±5.11 mV,TASK-KO小鼠中为-58.7 ±3.85 mV,TASK-KO小鼠中肾上腺皮质细胞及髓质细胞去极化表现比野生小鼠显著(P<0.05);在野生小鼠皮质及髓质细胞中,可记录到TASK离子通道对pH敏感的特征性电流,而在TASK-KO小鼠中,pH敏感电流缺失;本实验野生小鼠中,七氟烷作用下,可记录到明显的肾上腺皮质及髓质细胞电流改变,细胞兴奋性明显增加,影响了正常的应激系统,结合第二部分实验结果,证实其导致了肾上腺激素的减少;而在TASK-KO小鼠皮质及髓质细胞中,七氟烷的作用并未使细胞出现电流的明显波动,且肾上腺激素上升,说明此时,七氟烷对应激系统的抑制作用减弱。结论:电生理证实七氟烷通过肾上腺TASK离子通道抑制手术应激。