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目的:肝细胞肝癌是全球排名第五位的常见恶性肿瘤,其死亡率排在肿瘤死亡率的第三位。全球每年约有60万人死于肝癌。目前,已经确定的肝癌发病的危险因素中,乙型肝炎病(HBV)毒感染为最主要的危险因素。在世界各地,约有2.48亿人患有慢性乙型肝炎,在中国,有9500万人患有乙型病毒性肝炎,其中一些患者会缓慢发展成慢性乙型肝炎后肝硬化进而发展成肝细胞肝癌。目前,肝癌的诊治还存在早期诊断困难、缺乏有效治疗、复发转移率偏高、缺少创新药物等棘手问题,因此,对肝癌分子发病机制的研究和肝癌诊治新技术新药物的研发显得尤为重要。ALDH1A3是醛脱氢酶(ALDH)家族中的一员,主要负责将全反式视黄醛氧化成视黄酸而参与人体细胞的各种生理过程。越来越多的研究发现ALDH1A3表达受许多因素调节,并与肿瘤的发生、发展和预后相关。并且,ALDH1A3在多种肿瘤中表现出肿瘤干细胞(CSC)特征,与癌细胞的集落形成、球形成、肿瘤发生和血管生成活性密切相关。DNA甲基化作为表观遗传修饰的一种重要方式,在维持基因组DNA的基因印记、染色体的稳定、重复基因的转录沉默中起着重要作用。肝细胞肝癌表观遗传学上可发生广泛的DNA甲基化,且被证明与HBV感染相关,但HBV感染诱导DNA甲基化程度的改变在肝细胞肝癌发生发展中的作用尚未阐明。本研究利用肝癌组织临床标本及两种肝癌细胞系,采用甲基化芯片、甲基化PCR、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术,检测ALDH1A3基因在乙肝相关性肝细胞肝癌中甲基化程度及表达水平,初步探讨ALDH1A3基因与乙肝病毒感染性肝细胞肝癌的关系。方法:1.收集6例HBV高拷贝肝癌患者肝癌组织和6例无HBV感染肝癌患者肝癌组织标本均提取DNA,采用甲基化芯片技术对两组样本进行对比分析,筛选差异甲基化基因及差异甲基化位点,比较两组标本的整体甲基化状态及ALDH1A3基因甲基化程度的高低。2.收集并提取3例HBV高拷贝肝癌患者和3例无HBV感染肝癌患者的肝癌组织DNA,培养并提取表达HBV基因的HepG2.2.15肝癌细胞和HBV阴性的HepG2肝癌细胞的细胞DNA,根据芯片结果分析的差异甲基化位点设计ALDH1A3启动子区引物,采用甲基化特异性PCR(MSP)方法,在组织和细胞中进一步验证ALDH1A3基因启动子区甲基化差异。3.提取上一步骤中两组肝癌组织及两株肝癌细胞的总RNA和蛋白,采用Real-time PCR和Westernblot方法,分别对比组织及细胞中ALDH1A3基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。所有数据均采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),进行正态及方差齐性检验,检验以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.甲基化芯片分析结果显示:HBV高拷贝肝癌组织DNA整体呈现低甲基化状态,并且从存在甲基化差异的基因中筛选出ALDH1A3基因,呈现低甲基化状态。2.甲基化特异性PCR结果显示:HBV高拷贝肝癌组织ALDH1A3启动子区呈现低甲基化,而HBV阴性肝癌组织ALDH1A3启动子区呈现高甲基化,差异具有显著意义(P<0.01);HepG2.2.15细胞ALDH1A3启动子区呈现低甲基化,而HepG2细胞ALDH1A3启动子区呈现高甲基化,差异具有显著意义(P<0.01)。3.Real-time PCR和Western blot结果显示:HBV高拷贝肝癌组织较HBV阴性肝癌组织、HepG2.2.15肝癌细胞较HepG2肝癌细胞的ALDH1A3基因,在mRNA水平和蛋白水平的表达均升高,具有统计学意义(P<0.05)。结论:乙型肝炎病毒相关性肝细胞肝癌全基因组呈现低甲基化且HBV介导了ALDH1A3基因启动子区的去甲基化及高表达。