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失血性休克(Hemorrhagic shock, HS)能够通过启动机体固有免疫系统,触发全身炎症反应,甚至导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的发生。这一病理过程中,炎症启动的机理尚不明了。IL-1β在休克后全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)中有着重要的作用,炎症小体控制着IL-1β的成熟和释放。Pyrin蛋白由781个氨基酸组成,通过与核苷酸结合寡聚化域样受体蛋白(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein, NLRP)相互作用,可以抑制炎症小体的活化。内毒素(Lipopolysaccharide, LPS)以及细胞因子能够诱导Pyrin蛋白表达增加；在巨噬细胞,白细胞介素(Interluekin-10, IL-10)能够诱导Pyrin的表达上调。本课题试图证实失血性休克后,IL-10水平下调,Pyrin表达降低,炎症小体的活化失去负向调控,进而IL-1β在肺脏内的成熟及分泌增加,炎症反应过程进一步被放大。研究结果显示,LPS在肺内激活了NLRP3炎症小体的同时,也通过诱导IL-10上调了Pyrin的表达,抑制了炎症小体的活化。更为重要的是,LPS介导的IL-10能够上调Pyrin表达,在炎症后期,Pyrin通过抑制炎症小体活化,控制了炎症反应的发展。失血性休克后,IL-10在肺巨噬细胞(Alveolar macrophages, AM)内的表达减少,Pyrin在AM以及肺内皮细胞中表达降低,进而炎症小体活化增强,IL-1β分泌增加。本课题提出并阐释了新的失血性休克后炎症反应启动机制：失血性休克抑制了LPS介导的NLRP3炎症小体活化和IL-1β分泌的负反馈调节机制。第一部分：失血性休克增强内毒素诱导的肺组织内NLRP3炎症小体活化1.内毒素诱导的肺组织内NLRP3炎症小体活化能够被失血性休克所增强通过测定NLRP3和ASC的结合以及caspase-1的剪切成熟来判断肺内炎症小体的活化情况。通过野生型及NLPR3-/-小鼠,在失血性休克复苏后2小时气管内给予LPS或生理盐液注射,应用免疫共沉淀及免疫印迹方法测定肺组织NLRP3及ASC的结合以及caspase-1的剪切成熟,ELISA方法测定肺泡灌洗液中IL-1β水平。结果表明,失血性休克通过激活NLPR3-/-炎症小体从而增加了IL-1β的成熟、分泌。2.肺巨噬细胞在肺组织炎症小体活化中起主要作用为明确肺巨噬细胞在肺组织的炎症小体活化中所起的作用,小鼠失血性休克复苏2小时后进行肺泡灌洗,利用免疫磁珠分离系统纯化得到肺巨噬细胞。肺巨噬细胞体外给予LPS刺激(1μg/ml),测定炎症小体活化、caspase-1剪切成熟及IL-1β的释放。相比假手术组,在失血性休克组来源的肺巨噬细胞中,给予LPS刺激后,发生了更为显著的NLRP3和ASC结合、caspase-1剪切以及IL-1β释放。LPS诱导的肺组织及肺巨噬细胞内NLRP3炎症小体活化能够被失血性休克所增强。第二部分：失血性休克与Pyrin蛋白对肺组织炎症小体活化的作用机制研究1.失血性休克损害了肺内Pyrin蛋白表达上调Pyrin蛋白被认为能够抑制caspase-1活化及IL-1β成熟释放(13,20)。为明确失血性休克后,Pyrin蛋白对肺内炎症小体活化的调节,首先测定了失血性休克和／或LPS刺激后Pyrin蛋白在肺组织及巨噬细胞内的表达水平。在HS-LPS“两次打击”后,失血性休克明显降低了Pyrin蛋白在肺内的表达。小鼠肺巨噬细胞体外LPS刺激后,得到了类似的结果：LPS刺激后,假手术组来源的肺巨噬细胞Pyrin蛋白表达上调,而失血性休克组,失血性休克明显削弱了LPS诱导的Pyrin表达增加。2.失血性休克通过削弱IL-10产生抑制了Pyrin蛋白表达有文献报道,IL-10可以通过Jak3, Stat6以及NF-κB途径来诱导Pyrin蛋白的表达(20)。我们先前研究已经证明失血性休克降低了IL-10的表达,从而肺部炎症反应加重(29)。本研究中,我们进一步证实,通过TLR4及MyD88信号通路,LPS诱导了IL-10的肺内表达。在假手术和失血性休克组,外源性IL-10明显诱导了Pyrin蛋白在肺内的表达；重组IL-10与LPS复合注射,诱导了更高的表达量；而给予IL-10中和性抗体,无论假手术组或失血性休克组,Pyrin蛋白表达未见增加。以上研究表明,IL-10表达上调受损,导致了HS-LPS“两次打击”后Pyrin蛋白表达上调被抑制,炎症晚期更为明显。3. Pyrin蛋白表达减少导致了失血性休克介导的炎症小体激活为论证IL-10、Pyrin蛋白以及NLRP3炎症小体之间的关系,我们运用了siRNA技术,使鼠肺血管内皮细胞(Mouse lung vascular endothelial cell, MLVEC)内Pyrin蛋白表达沉默。转染后48小时,在LPS或IL-10诱导下,MLVEC细胞中Pyrin蛋白表达明显受损,LPS诱导的NLRP3-ASC结合明显增加,caspase-1剪切以及IL-1β释放也明显增加。Pyrin蛋白敲除后,即使给予外源性重组IL-10,MLVEC田胞的炎症小体活化及IL-1β释放并未减少,提示IL-10降低炎症小体活化的作用是通过Pyrin蛋白介导的。综上所述,我们获得以下结论：1.失血性休克能够增强LPS诱导的肺部炎症小体活化；2.肺巨噬细胞在肺组织炎症小体活化中起主要作用；3.失血性休克后抑炎因子IL-10表达受损,导致肺部炎症增强；4.失血性休克通过削弱IL-10产生从而抑制了Pyrin蛋白表达；5. Pyrin蛋白表达减少导致了失血性休克介导的炎症小体激活。本研究揭示了失血性休克致炎的新的机制,失血性休克通过抑制了LPS刺激后的炎症小体活化负反馈调节通路,能够增加促炎因子IL-1β的肺内表达,进而促进了炎症的发展。研究失血性休克后炎症反应中IL-10和Pyrin蛋白的调节规律,具有启发性意义。维持IL-10和/或Pyrin的表达或许能够为失血性休克后炎症反应的治疗提供新思路。