目的从OPG/RANKL破骨细胞调控通路和Wnt/LRP-5/β-catenin成骨细胞调控通路的角度,揭示具有滋补肾阴作用的左归丸和具有温补肾阳作用的右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用差异及其机制,以探讨“肾主骨”是否存在性别差异以及产生差异的机理,进一步阐明“肾主骨”的科学内涵,并为采用中医治疗骨质疏松症的临床用药提供实验依据。方法选用同周龄SD大鼠160只,SPF级,雌雄各半,先随机分为6组：雌、雄性空白对照组各12只,雌、雄性假手术组各12只,雌、雄性造模组各56只。于去势术前,先用Osteocore3Digital2D骨密度仪(双能x线)扫描所有大鼠腰椎4-6(L4-6) BMD,得到扫描图像待分析。之后分别对两组造模组大鼠行去势手术,即对雌性造模组大鼠切除卵巢,对雄性造模组大鼠切除睾丸(其中雄性假手术组1只、造模组雌、雄性大鼠各3只因手术麻醉死亡)。术后,再将两组造模组大鼠按体重随机分为8组：卵巢切除组(OVX组)13只、睾丸切除(ORX组)14只、戊酸雌二醇组(E2组)14只,甲睾酮组(T组)、雌、雄性左归丸组、雌、雄性右归丸组各13只。OVX大鼠OP模型制作：采用戊巴比妥钠腹腔注射全身麻醉雌性大鼠后,摘除双侧卵巢；雌性假手术组也施行开关腹腔手术,但未摘除卵巢,只摘除少量卵巢周围脂肪组织。ORX大鼠OP模型制作：用戊巴比妥钠腹腔注射全身麻醉雄性大鼠后,分离双侧睾丸和附睾并切除双侧睾丸；雄性假手术组也用同样的方法找到并剥离双侧睾丸,但不摘除。术后10天,对各给药组大鼠灌胃给药：雌、雄性左归丸组大鼠灌服左归丸水煎液,给药浓度为0.968g生药/ml；雌、雄性右归丸组大鼠灌服右归丸水煎液,给药浓度为1.024g生药/ml；戊酸雌二醇组大鼠灌服戊酸雌二醇水溶液,浓度为0.0092mg/ml;甲睾酮组大鼠灌服甲睾酮水溶液,浓度为0.092mg/ml。以上给药体积均为1ml/100g体重,每周称重一次,根据体重调整给药体积,每天固定时间(下午2点)给药,连续6天,休息1天后,再连续给药6天,如此给药3个月。雌、雄空白对照组,雌、雄假手术组,OVX组、ORX组大鼠按上法灌服等体积的纯净水(雌性右归丸组和雄性左归丸组各有1只大鼠因灌胃操作不慎死亡)。各组大鼠分别于处死前16天和前3天,腹腔注射盐酸四环素(剂量为30mg/kg体重),对骨组织进行荧光双标记。给药结束后,将大鼠用戊巴比妥钠腹腔注射进行全身麻醉,用骨密度仪扫描大鼠L4-6BMD,得到扫描图像待分析。然后,再将各组大鼠迅速处死,取右侧胫骨近端1/3,制作不脱钙骨切片,用于骨组织形态计量学指标的检测；取左侧胫骨近端1/3,制作脱钙骨冰冻切片,采用免疫组化法和原位杂交法分别检测OPG、RANKL、Wnt1、LRP-5、β-Catenin蛋白及其mRNA的检测。实验结果数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS20.0统计软件,若数据为正态分布时,采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理,方差齐性时组间两两比较,采用LSD检验；方差不齐时采用Dunnett’s T3(3)检验；若数据为非正态分布时,采用非参数检验Kruskal-Wallis单因素ANOVA(k样本)(W)；配对数据对比采用配对样本T检验。结果1左、右归丸对不同性别去势大鼠腰椎BMD及骨丢失率的影响除T组外,其余各组大鼠给药后腰椎BMD与去势前相比均有明显差异(P<0.05或P<0.01)。相同性别大鼠给药后腰椎BMD组间比较：模型组(OVX组、ORX组)较假手术组显著降低；E2组、雌性左归丸组、雌性右归丸组大鼠腰椎BMD均较OVX组显著增高,但仍低于假手术组；与ORX组相比,T组、雄性右归丸组大鼠腰椎BMD显著增高,雄性左归丸组则无显著差异,但均低于假手术组。其中,雌性左归丸组与雌性右归丸组、雄性左归丸组与雄性右归丸组之间均存在明显差异,且后者高于前者。相同性别大鼠给药后腰椎骨丢失率组间比较,结果显示：模型组(OVX组、ORX组)大鼠腰椎骨丢失较假手术组显著增加；E2组、雌性左归丸组、雌性右归丸组大鼠腰椎骨丢失均较OVX组显著减少,但仍明显多于假手术组；与ORX组相比,T组、雄性右归丸组大鼠腰椎骨丢失显著减少,雄性左归丸组则无显著差异,但均仍多于假手术组。其中,雌性左归丸组与雌性右归丸组、雄性左归丸组与雄性右归丸组之间骨丢失率均存在明显差异,且后者低于前者。不同性别大鼠给药后腰椎骨丢失率组间比较,结果显示：雌性与雄性假手术组、OVX组与ORX组、雌性与雄性左归丸组、雌性与雄性右归丸组之间骨丢失均有显著差异。其中OVX组骨丢失明显多于ORX组(P<0.01),雄性左归丸组则明显多于雌性左归丸组(P<0.05)、雄性右归丸组则明显多于雌性右归丸组(P<0.01),但雌性假手术组骨量增加明显低于雄性假手术组(P<0.05)。2左、右归丸对不同性别去势大鼠骨组织形态计量学指标的影响2.1左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨TBV%及骨丢失率的影响相同性别大鼠胫骨TBV%组间比较：模型组(OVX组、ORX组)较假手术组显著降低；雄性左归丸组与ORX组相比无统计学差异(P>0.05),其余各给药组均较同性别模型组显著升高,但仍明显低于同性别假手术组。其中,雌性右归丸组高于雌性左归丸组,雄性右归丸组高于雄性左归丸组,且之间差异有统计学意义。不同性别大鼠胫骨TBV%组间比较：雌性假手术组与雄性假手术组、OVX组与ORX组之间具有显著差异,且均为后者高于前者。相同性别大鼠胫骨骨丢失率组间比较,结果显示：模型组(OVX组、ORX组)骨量丢失明显多于假手术组；雄性左归丸组骨量丢失与ORX组相比无统计学差异(P>0.05),其余各给药组均较同性别模型组骨量丢失显著减少,但仍明显多于同性别假手术组。其中,雌性右归丸组骨量丢失明显少于雌性左归丸组(P<0.01),雄性右归丸组明显少于雄性左归丸组(P<0.05)。不同性别大鼠胫骨骨丢失率组间比较,结果显示：雌性与雄性假手术组、OVX组与ORX组、雌性与雄性左归丸组、雌性与雄性右归丸组之间骨量丢失均存在显著差异。其中OVX组骨量丢失明显多于ORX组(P<0.05),雄性左归丸组则明显多于雌性左归丸组(P<0.05)、雄性右归丸组则明显多于雌性右归丸组(P<0.05),但雌性假手术组骨量增加明显低于雄性假手术组(P<0.05)。2.2左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨TRS%、FS%及TRS/TFS比值的影响相同性别组间比较：模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨TRS%、TFS%及TRS/TFS匕值均较同性别假手术组明显升高。各给药组中,E2组、T组和雌性右归丸组上述参数均较同性别模型组显著降低,且均与同性别假手术组无统计学差异；雌性左归丸组大鼠胫骨上述参数也明显低于OVX组,但仍高于雌性假手术组,且二者存在统计学差异；雄性左归丸组大鼠胫骨上述参数与ORX组相比,无统计学差异；而雄性右归丸组大鼠胫骨上述参数较ORX组明显降低,但仍明显高于雄性假手术组。两种中药治疗组中,雌性右归丸组与雌性左归丸、雄性右归丸组与雄性左归丸组大鼠胫骨上述参数相比,均有统计学差异,且前者明显低于后者。不同性别大鼠胫骨TRS%、TFS%及TRS/TFS比值组间比较,结果显示：雌、雄性假手术组、模型组(OVX组和ORX组)、左归丸组和右归丸组之间上述参数均有统计学差异,其中,TFS%比较,雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸低于雄性左归丸,雌性右归丸低于雄性右归丸；与之对应,TRS%比较,雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸低于雄性左归丸,雌性右归丸低于雄性右归丸；TRS/TFS比值比较,雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组。2.3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨OSW、MAR和mAR的影响相同性别组间比较：模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨OSW、MAR和mAR与同性别假手术组相比,显著增高。各给药组中,与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组上述参数均显著下降,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组大鼠胫骨上述参数明显降低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组大鼠胫骨上述参数与之无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显下降,但仍明显高于雄性假手术组；与同性别左归丸组比较,雌性、雄性右归丸组MAR和mAR均明显降低,雄性右归丸组OSW较雄性左归丸组明显降低,雌性右归丸组OSW较雌性左归丸组有降低趋势(P=0.054)。不同性别大鼠组间比较,结果显示：模型组(OVX组和ORX组)、左归丸组和右归丸组两种性别之间上述参数均存在差异(P<0.05或P<0.01)。其中,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组。假手术组之间比较,OSW雌性较雄性无统计学差异(P>0.05),但有降低趋势；MAR和mAR则雌性显著低于雄性(P<0.05或P<0.01)。3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL蛋白和mRNA表达以及RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值的影响3.1左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓OPG蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓OPG蛋白和mRNA表达阳性密度均显著降低；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显著增高,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显升高,但仍明显低于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左、右归丸组OPG蛋白和mRNA表达阳性密度与其均无统计学差异(P>0.05)。不同性别组间大鼠胫骨骨髓OPG蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组低于ORX组,雌性左归丸组高于雄性左归丸组,雌性右归丸组高于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。3.2左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度均显著升高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显著减低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。3.3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值均显著升高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显著减低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值进行比较,结果显示：雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中Wnt1、LRP-5及β-catenin蛋白和mRNA表达的影响4.1左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓Wnt1蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓Wntl蛋白和mRNA表达阳性密度均显著增高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显著降低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓Wnt1蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4.2左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表达阳性密度均显著升高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显著降低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显降低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显降低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4.3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓B-catenin蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓B-catenin蛋白和mRNA表达阳性密度均显著增高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显著减低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减少,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减少,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓B-catenin蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。结论1.去势均可导致同龄不同性别大鼠发生高转换型骨质疏松症,即骨吸收和骨形成均增加,但由于骨吸收大于骨形成,而使骨量丢失。所不同的是,OVX大鼠的骨转换率显著高于ORX大鼠,骨丢失率也明显高于后者。OVX大鼠和ORX大鼠骨髓中RANKL表达均显著上调,而OPG表达均显著下调,两者的比值(RANKL/OPG)也均明显增高,从而使破骨细胞的活性增强,骨吸收增加；同时,Wnt1、LRP-5和P-catenin表达均显著上调,从而使成骨细胞的活性增强,骨形成增加。但由于破骨细胞活性增强的幅度大于成骨细胞活性增强的幅度,而导致骨质疏松症的发生；去势所致的雌性大鼠的上述改变明显强于去势的雄性大鼠。这是去势均可导致雌、雄大鼠发生高转换型骨质疏松症,但雌性大鼠的骨转换以及骨丢失率明显高于雄性的机理之一。2.左归丸、右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用存在明显差异：左归丸对OVX大鼠骨质疏松症具有明显的疗效,而对ORX大鼠骨质疏松症没有疗效；右归丸对OVX大鼠和ORX大鼠骨质疏松症虽均有明显的疗效,但对OVX大鼠的疗效要明显优于ORX大鼠。3.左归丸、右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用产生差异的机制：(1)左归丸产生差异的机制是,左归丸能使OVX骨质疏松症大鼠骨髓中RANKL表达显著下调,而使OPG表达显著上调；同时,使Wnt1、LRP-5和β-catenin表达显著下调；通过此作用,导致骨吸收与骨形成均降低,抑制骨的高转换,使骨吸收与骨形成达到相对的平衡状态,从而防止骨量的丢失。而左归丸对ORX骨质疏松症大鼠骨髓中的以上关键因子无明显影响。(2)右归丸产生差异的机制是,右归丸对OVX骨质疏松症大鼠骨髓中OPG、RANKL以及Wnt1、LRP-5和β-catenin的作用与左归丸的相同,只是右归丸的作用强度要明显高于左归丸。右归丸能使ORX骨质疏松症大鼠骨髓中RANKL以及Wnt1、LRP-5和β-catenin表达均显著下调；但对OPG表达无明显影响,并且对RANKL、Wnt1、LRP-5和β-catenin的作用要明显弱于对OVX骨质疏松症大鼠的作用,从而造成右归丸对OVX骨质疏松症大鼠骨的高转换的抑制作用要明显强于对ORX骨质疏松症大鼠,进而导致其对前者骨质疏松症的疗效要明显优于后者。4.以上结果表明,“肾主骨”存在性别差异,OPG/RANKL破骨细胞调控通路和Wnt/LRP-5/β-catenin成骨细胞调控通路发生不同改变,是造成这种差异的机制之一。5.对于OVX大鼠骨质疏松症,右归丸的疗效明显优于左归丸；对于ORX大鼠骨质疏松症,右归丸有效而左归丸无效。提示：肾阳虚,命门火衰可能是去势所致骨质疏松症发生的主要原因。