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目的: 建立野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型,采用单独表达eNOS和突变的Caveolin-1(F92A-Caveolin-1)基因,或同时表达两种基因修饰的BMSCs移植入PAH模型,应用构建慢病毒载体的方法探讨eNOS/F92A-Caveolin-1基因修饰BMSCs后对野百合碱诱发的肺动脉高压大鼠肺血管舒张功能、重建肺新生血管及血清IL-6和TNF-α的影响。探讨一种新的PAH的细胞生物治疗方法,通过基因突变使所转染的目的基因保持较高活性以增加肺血管舒张因子的分泌,同时促进肺组织的修复再生。研究成果为未来基于基因修饰的BMSCs治疗PAH的研究奠定科学的理论基础。 方法: 1、通过腹腔注射野百合碱60mg/kg,建立野百合碱(MCT)诱导的PAH大鼠模型。 2、采用Ficoll(1.077g/ml)密度梯度离心法从大鼠股骨及胫骨骨髓中提取并培养BMSCs。 3、携带eNOS/F92A-Caveolin-1基因的慢病毒载体的构建、鉴定;将构建的慢病毒载体感染 BMSCs。 4、进行BMSCs移植,观察对肺小动脉中膜厚度、右心肥大指数及肺血流动力学的影响。 5、取大鼠血进行血常规检测RDW(红细胞分布宽度),ELISA法测定血清中IL-6和TNF-α水平。 结果: 1、MCT诱导的大鼠PAH模型的制备:野百合碱呈时间依赖性增加大鼠的肺动脉压。与正常组相比,PAH组2W mPAP增高(P<0.01);5W mPAP与2W mPAP相比有显著性增高(P<0.01)。 2、成功分离骨髓间充质干细胞:原代经过三次传代以后,细胞形态趋于稳定、均一,细胞呈典型的纺锤样,鱼群样或螺旋状贴壁生长。所培养的BMSCs细胞流式细胞鉴定:表面抗原标志物CD90阳性(92.77±14.36)%,CD44阳性(91.60±1.51)%,CD34阴性(12.5±1.21)%,CD31阴性(8.03±1.15)%。 3、带有GFP标记的eNOS/F92A-Caveolin-1基因感染的BMSCs移植后在荧光显微镜下观察各组慢病毒感染BMSCs的效率达85%以上。 4、与对照组相比,NO的终末稳定产物Nitrite的含量以eNOS/F92A-Caveolin-1组最高(P<0.01),同时发现作为氮自由基的NO的增高,并不影响各组BMSCs细胞的活性(P>0.05)。血管形成实验发现eNOS/F92-Cav1组BMSCs的血管形成能力最强。 5、野百合碱升高大鼠的肺动脉压力,增大右心肥大指数,增加肺小动脉中膜厚度。 6、野百合碱诱发的肺动脉高压大鼠炎症指标IL-6和TNF-α平均水平显著升高,经基因治疗后IL-6和TNF-α水平与PAH组相比有显著性降低。IL-6:Ctr(93.30±11.02)VS PAH(140.08±6.27);PAH(209.34±19.80)VS BMSCs(156.36±2.68)pg/ml;TNF-α:Ctr(951.33±51.46)VS PAH(1148.98±51.56),PAH(1578.65±50.02)VS BMSCs(1421.88±48.35)pg/ml, P均<0.05。 结论: 1、成功构建了携带目的基因eNOS/F92A-Caveolin-1的重组慢病毒质粒,为后续实验中高效基因转染及探讨其生物学作用奠定了基础。 2、成功将慢病毒载体介导的eNOS和F92A-caveolin-1基因单独或联合感染BMSCs。 3、各组慢病毒颗粒可高效感染BMSCs,感染效率达85%以上,其中共感染eNOS和F92A-Caveolin-1慢病毒颗粒的BMSCs组的NO含量最高,但NO含量的增高对BMSCs细胞活性无明显杀伤作用,同时仍具备较强的血管形成能力。 4、制备了野百合碱诱导的大鼠PAH模型,并将eNOS和F92A-caveolin-1基因感染的BMSCs静脉注射到PAH模型体内。注射后能够有效地降低MCT诱发的大鼠肺动脉压,抑制肺血管的重构,减轻右心室肥大。 5、eNOS/F92A-Caveolin-1基因修饰骨髓间充质干细胞能够有效地降低MCT诱发的肺动脉高压大鼠的血清IL-6和TNF-α炎症介质。