过敏,指已免疫的机体再次暴露于相同过敏原时所产生的功能紊乱反应。过敏原种类极多,其中,尘螨诱发的过敏性疾病是世界范围内最为常见的一类疾病。临床数据显示超过80%的尘螨过敏患者对过敏原Der p2产生过敏反应。目前,对于过敏的预防及治疗尚无有效的手段,避免接触是现行的最为主要的控制过敏的方式,但无法从根本上消除过敏的威胁。益生菌疗法被认为是一种极具潜力的治疗方式,但其临床效果与人们的预期之间存在一定的差距。研究者认为通过对益生菌进行一定的分子改造可以提高益生菌的治疗效果。本文通过对重组乳酸菌的研究,寻求一种预防及治疗尘螨过敏的有效途径。本文的主要研究内容如下:1.外源蛋白在重组乳酸菌中的表达部位可能影响重组菌株在体内的免疫效果。为确定最合适的表达方式,本研究将Der p2在重组乳酸乳球菌的不同部位表达,并对其在体内的免疫效果进行分析。动物实验表明三种不同的重组乳酸菌都可以抑制过敏小鼠肺部组织中Th2细胞因子IL-4和IL-5的表达,降低炎症细胞在肺部组织中的浸润反应,缓解过敏原诱发的肺部炎症反应。此外,重组乳酸菌通过调节过敏小鼠体内的细胞免疫反应,增加特异性Ig G2a的表达,抑制特异性Ig E的产生。重组乳酸菌对过敏反应的抑制作用可能与其诱导增加的肠系膜淋巴结中Tregs的表达有关。不同的重组乳酸菌在体内具有相似的免疫效果,表明Der p2在重组乳酸菌中的表达部位并不会影响重组乳酸菌在体内的免疫效果。2.过敏原Der p2用于尘螨过敏治疗或预防时,无法避免Ig E介导的副反应的发生,但破坏过敏原的空间结构可以降低或消除其与Ig E的结合能力。本研究基于Der p2基因序列,通过改变其线性序列和敲除与蛋白折叠有关的位点可以得到一段新的基因,表达包含Der p2大部分氨基酸序列但空间结构又与Der p2不同的衍生物蛋白DM。体外研究证实DM消除了与尘螨过敏患者体内Der p2特异性Ig E的结合能力,保留了与T细胞反应的能力。为验证DM的免疫特性,DM基因被转入重组乳酸菌LL-DM中分泌表达。动物实验表明重组乳酸菌LL-DM可以抑制小鼠体内过敏反应的发生,其抑制效果及保护机制与表达Der p2的重组乳酸菌相比并没有显著性差异。3.相比大分子过敏原衍生物,过敏原小分子片段不仅可以避免Ig E介导的副反应的发生,还可以减少激活的效应细胞引发的不良反应。本研究通过对Der p2氨基酸序列的分析,得到5段含有Der p2主要T细胞位点的多肽片段。体外研究证实Der p2多肽片段消除了与特异性Ig E的结合能力;但与DM不同的是Der p2多肽片段与T细胞反应的能力明显降低。为验证Der p2多肽片段的免疫特性,多肽片段基因被分别转入重组乳酸菌中分泌表达。动物实验表明重组乳酸菌表达的多肽片段混合物可以有效地抑制小鼠体内过敏反应的发生,其保护机制与表达DM的重组乳酸菌基本相似,但其效果要稍弱于DM。考虑到过敏治疗的长期性,Der p2多肽片段混合物比DM更具治疗潜力。4.目前的研究证实表达外源蛋白的乳酸乳球菌并不是一株具有明显抗过敏特性的益生菌,因而可能影响重组乳酸菌在体内的抗过敏效果。为得到具有抗过敏特性的菌株与重组乳酸菌复配使用,本研究通过细胞实验对不同来源、不同种属的乳酸菌进行初筛。结果表明相比其他菌株,S.thermophilus CCFM218(ST218)可以诱导IL-10的表达抑制IL-4的产生,是一株具有潜在抗过敏特性的益生菌。动物实验证实ST218虽不能抑制过敏小鼠体内特异性Ig E的表达,但可以增加特异性Ig G2a的产生缓解过敏反应。此外,ST218可以抑制肺部组织中Th2细胞因子的表达降低炎症细胞在肺部组织中的浸润反应,缓解过敏原引起的肺部炎症反应。ST218对过敏反应的抑制作用与其对肠道菌群及粘膜免疫的调节作用密切相关。5.为分析ST218对重组乳酸菌抗过敏效果的影响,本研究对两者混合物在小鼠体内对过敏反应的抑制效果进行检测。结果表明ST218明显增强了重组乳酸菌对特异性Ig E表达的抑制作用,这与ST218对肠系膜淋巴结中Tregs的调控表达有关。肺部炎症因子的分析表明ST218和重组乳酸菌的混合物可以降低过敏原诱发的炎症反应,但与重组乳酸菌处理组相比并没有显著性差异,这可能与目前的炎症水平较低有关。综上所述,本研究通过对蛋白表达部位、蛋白结构及表达载体等影响重组乳酸菌在体内免疫效果相关因素的研究,探究一种可以安全有效预防尘螨过敏的有效方式,为未来重组乳酸菌疫苗在临床及生产中的实际应用提供重要的理论依据和参考价值。