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谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)存在于所有生物体内,能够可逆性催化L-谷氨酸和α-酮戊二酸之间的氧化性脱氨与还原性胺化反应,在细胞内信号转导、三羧酸循环、氨代谢和能量代谢中起重要作用。目前已在多种细菌、动物、植物及顶复门原虫等生物中获得GDH基因的全长序列,通过氨基酸序列比对发现,它们之间存在较多的保守结构域。对疟原虫GDH的研究发现该酶能参与寄生虫特殊的能量代谢途径。鉴于GDH的重要生物学功能,本研究对柔嫩艾美耳球虫GDH基因进行了克隆、表达及其酶动力学分析。根据基因组数据库中注释预测的柔嫩艾美耳球虫GDH(EtGDH)基因序列设计特异性引物,以该虫裂殖子总RNA为模版,用RT-PCR方法扩增EtGDH基因序列,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,EtGDH基因的ORF序列长1407 bp,编码468个氨基酸;该蛋白理论分子量大小为50.96 kD,理论等电点(PI)为6.93,不含信号肽,无跨膜结构域;将EtGDH与不同物种GDH氨基酸序列进行比对,该蛋白氨基酸序列之间具有较强的保守性;预测的EtGDH单体蛋白由15个α螺旋和12个β折叠组成。选用pET-32a作为原核表达载体,将测序正确的阳性克隆质粒与表达载体进行BamH I和Hind III双酶切,切胶回收后经T4 DNA Ligase连接,构建pET-32a-EtGDH重组质粒,并转化至大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)菌株,对IPTG的诱导量、诱导温度进行优化。pET-32a-EtGDH表达条件确定为在16℃下用1 mM IPTG诱导16 h。SDS-PAGE凝胶电泳检测重组蛋白的存在形式,结果显示rEtGDH为部分可溶性蛋白。利用Ni柱亲和层析法纯化,获得了较纯的融合蛋白,经Western-blot鉴定为目的蛋白。将纯化的rEtGDH进行酶活性测定,同时探究pH及温度对酶活性的影响,并进行了酶动力学及抑制动力学分析。结果显示,EtGDH最佳反应pH为9.0,最佳反应温度为42℃。EtGDH对NADP+的Km值为42.7±3.17μM,对L-Glu的Km值为3.52±0.32 mM;EtGDH的最大反应速率为4.089 nmol/min/mg,与其他物种具有一定的差异。六氯酚、硫氯酚、GW5074、氯喹、4’,5,7-三羟基黄酮、维生素K3和鞣酸对EtGDH具有一定的抑制作用,其IC50值分别是26.39±0.58μM、158.17±0.71μM、57.78±2.67μM、89.31±3.37μM、65.94±2.45μM、406.19±1.95μM和12.11±1.69μM。本研究首次成功地克隆了EtGDH基因,构建其重组表达载体并成功地进行了诱导表达,系统分析了重组蛋白的体外活性及其生化特性,建立了一个以EtGDH为靶标的抑制剂体外筛选模型,并筛选了一些具有抑制活性的化合物,为新型抗球虫药物的研发和潜在靶标的筛选奠定了理论基础。