论文部分内容阅读
目的:肺炎支原体（Mp）是引起社区获得性肺炎的重要病原体。课题组前期研究表明机体免疫系统通过Toll样受体（TLR）2/6和TLR1/2识别Mp并参与炎症反应发生。但最新研究表明TLR4也参与识别Mp并能够诱导巨噬细胞分泌炎症因子,其机制与激活TLR4介导的自噬相关通路有关。由于Mp缺乏细胞壁,因此也缺乏TLR4相应的配体LPS,但是其膜上存在丰富的脂质。本研究旨在探究Mp脂质能否诱导RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子,并探讨其作用机制。方法:体外培养Mp,并提取其脂质。并将不同浓度的脂质刺激体外培养的RAW264.7细胞,随后开展以下研究:1.分别采用1、10、30、60和120μg/mL脂质刺激RAW264.7细胞24h,ELISA检测处理前后IL-1β和TNF-α的变化;2.采用（10μg/mL）TLR2或TLR4中和抗体预孵育细胞1h,或采用TLR2或TLR4 siRNA沉默其表达,以明确TLR2或TLR4在脂质诱导TNF-α和IL-1β分泌过程中发挥的作用;3.采用120μg/mL脂质处理RAW264.7细胞6h,免疫荧光检测NF-κB的核转位,Western Blot检测IκB表达变化。并采用TLR2或TLR4中和抗体预处理细胞,观察TLR2和TLR4在脂质活化NF-κB中的作用。最后采用NF-κB抑制剂预处理细胞40min,ELISA检测TNF-α和IL-1β分泌水平,以明确NF-κB在介导促炎细胞因子分泌中的作用。4.120μg/mL脂质处理RAW264.7细胞18h,或加入NF-κB抑制剂BAY 11-7082预处理细胞,qRT-PCR检测NF-κB在介导NLRP3mRNA表达中的作用;采用H2DCF-DA分子探针检测巨噬细胞内活性氧（ROS）的水平,或采用TLR2或TLR4抑制剂预处理以证实TLR2和TLR4对ROS分泌的影响;或同时采用ROS清除剂NAC处理细胞,观察ROS在活化NLRP3以及诱导IL-1β中的作用;5.采用免疫荧光检测脂质处理前后LC3Ⅱ斑点的变化,并观察抑制TLR2或TLR4后对LC3Ⅱ斑点的影响,或采用Western blot检测自噬相关分子LC3Ⅱ、Beclin-1和p62的表达,以明确TLR2或TLR4在介导脂质所致自噬中所发挥的作用;并采用自噬抑制剂3-MA预处理,或沉默agt5或beclin1,观察自噬在脂质诱导TNF-α和IL-1β中的影响;6.采用3-MA预处理或RNA干扰agt5或beclin1,观察其对NF-κB核转位的影响;或采用NF-κB抑制剂处理细胞,通过Western blot或免疫荧光检测LC3Ⅱ蛋白表达或斑点形成的影响,以明确自噬和NF-κB之间的关系。结果:1.脂质浓度低于30μg/mL时,并不能诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-1β,但用30120μg/mL脂质孵育后,细胞培养上清中TNF-α和IL-1β显著增高;且LDH实验证实,在该浓度范围内脂质对细胞无明显毒害作用。2.转染TLR2 siRNA或用TLR2中和抗体预处理细胞后,对脂质诱导IL-1β和TNF-α分泌无明显影响,而转染TLR4 siRNA或用TLR4中和抗体预处理后,TNF-α和IL-1β水平明显减少。3.免疫荧光结果显示,采用120μg/mL脂质处理RAW264.7细胞12h,可诱导NF-κB p65核转位,伴有IκB水平的降低。TLR2中和抗体处理并不影响p65核转位和IκB表达,但给予TLR4中和抗体处理后,可显著抑制脂质对p65的核转位以及IκB的降解。此外,给予NF-κB抑制剂BAY11-7082处理后,TNF-α和IL-1β分泌明显减少。4.脂质刺激RAW264.7细胞18h后,qRT-PCR结果显示NLRP3mRNA转录水平增加,NF-κB抑制剂预处理后可下调NLRP3的mRNA转录水平;脂质也能上调RAW264.7细胞内ROS水平,TLR4中和抗体孵育后ROS明显减少,而TLR2抗体对其无明显影响;脂质也能上调caspase-1 p10亚基的表达,采用ROS抑制剂NAC处理后,p10水平明显降低。ASC斑点也显著减少,IL-1β分泌也有所降低。5.脂质处理后,LC3斑点明显增多。TLR2中和抗体并不影响LC3Ⅱ的表达,但抑制TLR4后斑点明显减少。Western blot证实,脂质处理后可上调LC3Ⅱ、Beclin1和ATG5的表达。采用溶酶体融合抑制剂氯喹处理后,LC3Ⅱ表达明显增加,p62表达有所增高。采用自噬抑制剂3-MA处理细胞后,脂质诱导的TNF-α和IL-1β有所降低,干扰ATG5或Beclin1后,也得到了类似的结果。6.采用自噬抑制剂3-MA预处理细胞,或采用siRNA干扰Beclin-1或ATG5后,NF-κB核转位被抑制。采用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理细胞,LC3Ⅱ的表达下调,斑点形成也有所降低。结论:1.肺炎支原体脂质经TLR4诱导小鼠巨噬细胞自噬并激活NF-κB和NLRP3;2.自噬与NF-κB可形成正反馈环,进一步促进TNF-α和IL-1β分泌。