红花檵木叶色变化的基因表达差异分析与内参基因的筛选

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红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)是长江中下游及以南地区具有丰富园林用途的主要彩叶植物之一。生产上红花檵木红色叶片的表型稳定性是判断其观赏品质好坏的一个重要依据,但在长沙地区红花檵木的叶色夏季“返青”现象非常普遍,虽然相关研究对其叶色变化的生理生化机制进行了一些探讨,但还不能完全从根本上解释其叶色变化机理。本研究以“长叶玫红”,“花叶2号”,“大叶红”及“玫红细叶青”四种不同类型的红花檵木为材料,通过对其叶色变化的基因表达差异性的分析及实时荧光定量内参基因筛选的研究,以期为揭示红花檵木叶色变化的分子机理奠定基础。论文的主要研究结果如下:1.对红花檵木颜色变化前后的叶片进行了cDNA-SRAP分析,筛选出1个特异表达差异片段提取自然环境下不同月份的4个红花檵木材料的RNA,通过对其cDNA-SRAP扩增产物的电泳图谱分析得知,4个红花檵木之间,同一材料不同时间的条带存在明显的差异,差异带的大小主要集中在750~1000bp之间。另外,通过对4对多态性好的引物组合(Me1Em1、Me1Em2、Me2Em1、Me2Em2)的琼脂糖凝胶电泳结合与聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,从“长叶玫红”7月份的Me1Em1引物扩增产物中筛选了一个表达差异特别明显的片段进行了回收与测序。在NCBI数据库BLAST检索中进行核酸序列同源性比较,结果没有发现这个回收片段的核酸同源性序列,可能是一个与“长叶玫红”在7月份叶色差异表达密切相关的基因,至于其表达特性和功能还有待进一步的研究和鉴定。2.对红花橙木叶片THS、DFR、ANS三个花色素苷合成相关基因的表达进行了初步分析提取自然环境下不同月份的四个红花檵木材料的RNA,根据CHS、DFR、ANS各自保守序列设计特异引物进行RT-PCR分析,CHS基因在5、6、7、8月下旬的四个材料中都有表达,但在5和6月的表达量较大,在7和8月下旬的表达量明星减弱;ANS基因只在5、6和8月下旬的“长叶玫红”和“大叶红”中有表达,在其他材料及7月下旬都没有表达;DFR基因只在四个材料的5、6月下旬的叶片中有极微弱的表达,7和8月下旬在四个材料中没有检测到有DFR基因的表达。通过扩增效果的比较,选取根据CHS保守序列扩展的特异片段进行回收、克隆测序。测序结果在NCBI数据库BLAST检索中进行核酸序列同源性比较,四个特异片段与红花檵木(CHS1)mRNA的核苷酸序列同源性高达97%以上,与核桃,八仙花,茶树,葡萄,木麻等植物的CHS基因同源性达81%-83%。3.选择了2个适合红花檵木叶色相关基因Real-Time RT-PCR分析的内参基因以红花檵木“大叶红”的芽、叶、嫩茎、花瓣和愈伤组织为材料,应用Real-Time RT-PCR技术,分析了a-tubulin、β-actin、18S rRNA和GAPDH4个常用内参基因在红花檵木不同的器官组织中的表达情况。经NormFinder和GeNorm软件分析发现,当利用荧光定量PCR分析比较红花檵木不同器官组织中的基因表达差异时,可选择GAPDH乍为校正内参基因;而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时,可以选择β-actin作为校正内参基因。
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