番茄(Solanum lycopersicum)为世界性重要蔬菜之一,在我国蔬菜产业中具有重要地位,同时也是生物学模式生物之一。干旱直接威胁着番茄植株的生长发育,导致产量和品质下降。如何提高番茄自身的抗旱能力,培育优良耐旱新品种,已成为迫切需要解决的问题。对植物耐旱机理的解析,前人已从生理生化、细胞结构及分子等水平进行了大量研究,并取得重要进展。植物主要通过增厚表皮蜡质层、改变气孔开度、形成发达根系和贮水组织等结构适应干旱；渗透调节物的形成、保护酶活性的提高、膜系统稳定性的维持、内源激素的调节、次生代谢物的合成等生理生化代谢都参与植物对干旱的防御；对植物耐旱的分子机理研究,近年已克隆了一大批耐旱相关基因,在植物抵御干旱过程中起直接保护或调控作用。干旱等逆境下,植物体内受ABA调控与非依赖ABA调控基因之间互作,形成复杂网络,共同调节多条信号途径转导和转录因子活性,激发下游基因表达,对干旱做出响应。本研究以耐旱野生番茄S. pennellii与栽培番茄种S. lycopersicum cv M82及由二者构建的一套渐渗系为研究材料,从形态结构特征,分析耐旱番茄的结构特点；通过生理生化指标与耐旱性的相关性,建立适合耐旱番茄筛选的鉴定指标；利用microarray技术,从转录、信号转导及细胞分化等生物进程,分析番茄响应干旱的调控机理,候选耐旱相关基因,进行功能验证,为番茄的耐旱性改良和耐旱机理分析提供重要理论指导和实践依据。本研究的主要结果如下：1.耐旱番茄的形态特性分析。通过对耐旱野生番茄S. pennellii与普通栽培种番茄S. lycopersicum M82形态结构的比较,分析S. pennellii的耐旱结构特点。S.pennellii植株叶、茎及花萼等地上组织全部被浓密表皮毛和粘稠腺体分泌物覆盖,利于减少水分散失的同时可能又有助于吸收空气中的水分；叶上表皮气孔数目较多,可以为吸收粘附在表皮的“露水”进入体内提供通道；叶片表皮细胞排列致密,也有利于减少体内水分散失；栅栏组织与海绵组织之比变大,可以增强机械强度；茎中薄壁组织发达,可能储藏大量水分,供应干旱等逆境下生长所需；而欠发达的根系和叶脉等组织则在S. pennellii耐旱机理中发挥并不重要的作用。2.建立番茄耐旱评价指标体系。通过对叶片相对含水量、细胞伤害率、丙二醛含量、超氧化物岐化酶含量、脯氨酸含量等生理生化指标与耐旱性之间的相关性分析,建立适合耐旱性番茄筛选的检测指标。结果表明,轻度、中度、重度干旱胁迫下,叶片相对含水量都可用于鉴定番茄材料的耐旱性。3.番茄干旱响应基因分析。利用筛选的耐旱渐渗系与M82,结合microarray技术,分析番茄响应干旱的调控机理。每种参试材料都获得超过1,200个差异表达基因,其中耐旱系中有359个单独表达基因。通过生物学进程分析,表达基因在逆境响应中占主要比例。耐旱系可能通过特异表达的转录因子基因(编码Zinc-finger、NAC、bHLH、AP2/EREBP及HSF等家族蛋白)、信号转导基因(编码受体蛋白激酶、促细胞分裂活性蛋白激酶、钙调结合蛋白、磷酸酯酶及膜蛋白等)、组织生长发育相关基因和一系列单独变化的生化途径(糖异生、色氨酸降解、嘌呤核苷酸生成、过氧化物清除、淀粉降解、甲硫氨酸合成)等方式调节耐旱性。而耐旱系和M82中共同表达的基因和共同变化的生化途径,如次生代谢物、无机营养、糖和多糖、氨基酸家族、激素等的合成或分解,可能分别为番茄对干旱的基本响应基因和代谢调控方式。4.耐旱候选基因的分析。利用芯片结果,选取耐旱系与M82中有差异表达的干旱响应基因,为候选耐旱相关基因,克隆基因开放阅读编码框,对其编码蛋白序列及结构进行预测分析。5.候选基因的表达模式。通过半定量RT-PCR法,分析候选基因在番茄不同组织器官,以及在不同干旱胁迫程度和不同外界因子作用下的表达模式。结果表明,候选基因SIWRKY、SpWRKY、SINAC表达具有组织特异性,在成熟叶和茎中表达量都较高,而在果实和/或根中不表达。候选基因SITR、SpTR和SpNAC则在根、茎、叶、花、果中都表达,但在果实和根中表达量仍比茎和叶中低。大部分候选基因在中度、重度胁迫下比轻度胁迫下表达变化明显。在盐、高低温及ABA较长时间作用下,大部分候选基因都被诱导；而在SA作用下,除NAC基因外,其它基因都被诱导。6.候选基因的染色体定位分析。利用番茄基因组测序结果、扩增片段多态性和酶切扩增多态性序列法,对候选基因进行染色体定位。SpTR基因定位于第11染色体11-D区；SpWRKY基因定位于第8染色体,包含于克隆代号为C08SLe0011M12的BAC库中；SpNAC基因定位于第10染色体10-D区域。7.候选基因的转基因创建、表达分析及转基因番茄的耐逆性鉴定。构建候选基因超量表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,将候选基因转入番茄栽培种中蔬5号中。通过PCR法检测,获得超量表达SpTR阳性植株14棵,超量表达SpWRKY阳性植株13棵,超量表达SpNAC阳性植株19棵。利用半定量RT-PCR法,鉴定转基因植株叶片中目的基因的表达量明显高于野生型。检测超量表达目的基因番茄幼苗的耐逆性,结果表明,SpTR和SpWRKY超量表达后,可增强转基因番茄幼苗的耐旱性、耐盐性和耐低温性。