西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)属黄病毒科黄病毒属，经蚊媒传播，多种鸟类和哺乳动物对该病毒易感，是一种重要的人兽共患传染病病原，野生鸟类尤其是乌鸦为WNV的储存宿主，人群对WNV普遍易感，人感染后可导致西尼罗热，临床上主要表现为发热、脑炎甚至死亡等。　　目前针对WNV尚无特异性治疗方法，亦无人用WNV疫苗。急需开展WNV防控相关研究，WNV研究中相关病毒操作需在较高级别生物安全实验室进行，如生物安全3级实验室(BSL-3)，活病毒操作存在感染与泄露风险，制约了WNV疫苗及药物的研究。因此，本实验拟建立表达绿色荧光蛋白(GFP)的限制性复制WNV，为WNV中和抗体检测、抗病毒药物筛选及感染机制研究建立技术平台。　　本研究参考WNVNY99株基因组序列，分段合成除结构蛋白基因外的其它基因组序列，在缺失的结构蛋白基因位置插入gfp报告基因序列，并按WNV基因组顺序克隆于pCI-neo载体中，构建含有GFP蛋白基因的重组WNV复制子质粒pWNVrepdCME-GFP。同时构建表达WNV C蛋白的重组质粒pCAG-WNV-C、稳定表达WNV PrM/E蛋白的细胞系BWNV-ME及稳定表达WNVC/PrM/E蛋白的细胞系BWNV-CME。当复制子质粒pWNVrepdCME-GFP和表达C蛋白的质粒pCAG-WNV-C共转染BWNV-ME细胞，或用复制子质粒单独转染稳定表达C/PrM/E的细胞系BWNV-CME时，转染细胞都能够表达GFP，均可包装得到高滴度WNV复制子颗粒(＞106 PFU/mL)，包装得到的WNV复制子颗粒命名为RRPs。将转染细胞培养液接种BHK-21细胞后，能感染细胞并且表达GFP。然而，感染BHK-21细胞的培养液不能再感染BHK-21细胞，说明RRPs只具有一次感染能力;而感染BWNV-CME细胞时，由于细胞系能稳定表达WNV全部结构蛋白，所以能够不断包装出子代病毒，在BWNV-CME细胞中可类似于活病毒复制繁殖且造成细胞病变。如果在细胞培养液中加入羧甲基纤维素，释放的RRPs只能由最初感染的细胞向周边扩展，一定时间后，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒噬斑。感染实验表明RRPs对Vero、HEK-293、BHK-21和SK-N-SH四种不同类型细胞有不同嗜性，且对Vero易感性最高，与文献报道WNV活病毒感染细胞特性一致，可用于WNV入侵细胞机制研究。根据RRPs在BWNV-CME细胞系中能够复制并形成噬斑，我们建立了噬斑减少中和试验(PRNT)，用于中和抗体检测和抗病毒药物筛选。用PRNT实验对WNV VLP亚单位疫苗免疫的鼠、鹅和马血清进行了检测，对小鼠血清测得中和抗体效价为1∶80～1∶160，与用WNV活病毒测定的结果相符合。ELISA测得的鹅和马阳性血清用PRNT实验测定时也呈阳性，抗体效价可达1∶160～1∶320。这些结果表明所包装得到的的RRPs可以代替活病毒用于中和试验，能够用于疫苗免疫效果评价。RRPs感染BWNV-CME细胞过程中加入不同浓度抗WNV药物Ribavirin和6-Azauridine，结果发现:不同浓度的药物能够不同程度的抑制WNV的繁殖，验证了RibavMn和6-Azauridine的抗病毒作用，表明该系统可以作为一个安全有效的抗WNV药物筛选平台。　　综上所述，本研究建立了限制性复制的WNV复制子颗粒系统。为WNV的疫苗评价、抗病毒药物筛选以及为研究病毒入侵与复制提供安全、便捷的技术平台。