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目的:超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）是一种广泛存在于生物体内的金属酶,催化生物体内超氧阴离子自由基（·O2-）发生歧化反应,能清除机体代谢过程中产生的过量·O2-,延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象,如延缓皱纹和脂褐素沉淀的出现。SOD应用于化妆品可抵抗自由基对皮肤的侵害,避免皮肤被氧化损伤,起到抗衰老、防晒、消炎等功效。但是,目前化妆品用SOD存在热稳定性差,不耐酸碱,不耐表面活性剂,不耐紫外线,易被蛋白酶降解等缺点,这些缺陷在很大程度上限制了 SOD在化妆品的广泛应用。嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27是一株极端嗜热好氧细菌,该菌株所产生的SOD具有较好的热稳定性,但是不耐表面活性剂和紫外线照射等,仍然不能满足化妆品领域的应用要求。因此,本研究对嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27的MnSOD进行分子改造,以期能筛选出适合添加至化妆品的稳定型MnSOD。方法如下:1.构建原核表达载体pET-28b-MnSOD,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞表达,经过Ni-NTA亲和层析柱纯化得到重组MnSOD。2.利用邻苯三酚自氧化活性测定法对MnSOD的热稳定性、pH稳定性、表面活性剂和金属螯合剂耐受性等酶学性质进行探究。3.通过多序列比对和在线预测平台PremPS等生物信息学手段对嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27来源的MnSOD进行氨基酸突变位点筛选,利用无缝克隆法构建突变型表达载体pET-28b-ΔMnSOD并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞表达,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化得到突变体。根据热稳定性、pH稳定性、表面活性剂和金属螯合剂耐受性等稳定性实验筛选突变体。通过同源建模,从三维结构的角度分析野生型MnSOD和突变体之间的差异。4.研制一款含SOD的O/W型乳液,通过单因素实验法结合稳定性评价、酶活力评价和感官评价对乳液配方中的油脂复配比例、乳化剂复配比例、增稠剂复配比例和乳化工艺中的乳化温度、乳化转速、乳化时间进行优化。结果如下:1.成功得到重组野生型MnSOD,酶学性质研究表明MnSOD热稳定性好,在70℃条件下孵育48 h,相对剩余活力为85.83%,具有较好的pH稳定性,在pH 5～8的范围内比较稳定。离子型表面活性剂SDS和CTAB使重组MnSOD快速失活,而非离子型表面活性剂Tween-80不会抑制重组MnSOD的活力,在低浓度条件下对酶活力还有微弱的激活作用。高浓度的金属螯合剂EDTA-2Na可以通过大量络合SOD活性中心的Mn2+使其完全失活。2.成功获得了 L117F、L121F、K138V、A182P四个酶活力较高的突变体。酶学性质研究表明,K138V与A182P具有更强的耐酸性和热稳定性,L117F和A182P对SDS的耐受性稍强,CTAB对四个突变体和野生型MnSOD的失活作用没有明显差别,浓度小于1%的非离子型表面活性剂Tween-80对四个突变体和野生型MnSOD的活力没有影响。当EDTA-2Na浓度大于1 mM时,K138V和A182P对EDTA-2Na的抵抗能力更强。野生型MnSOD的荧光光谱结果结合PDB数据库晶体结构三维模型推测Trp169、Trp133以及Trp88是MnSOD荧光光谱的主要贡献氨基酸残基。野生型MnSOD的圆二色光谱显示了典型的α螺旋特征峰,α螺旋约占70%。3.同源建模分析表明,A182P位于蛋白质结构表面,可在外部通过增加键能等方式稳定结构,此外,活性中心Mn2+与结合氨基酸的距离相对最短,表明Mn2+与蛋白质的结合更加牢固,并且在活性中心附近形成了两个新的螺旋,进一步稳定了局部空间结构,有助于在极端环境中保持酶活力,这可能是A182P稳定性最强的原因。4.成功研制出一款含MnSOD-A182P和大分子量透明质酸钠的O/W型乳液。最优的乳液配方为:9%二甲基硅油,4%白凡士林,2%GMS-165单硬脂酸甘油酯,1%十六十八醇,0.05%卡波姆U20,0.05%黄原胶,4%甘油,3%1,3-丁二醇,1%Phenonip XB,适量三乙醇胺,0.1%透明质酸钠,0.1%MnSOD-A182P。最优的制备工艺为:乳化温度85℃,乳化转速300 rpm,乳化时间30 min。乳液成品的酶活力评价结果表明,含有MnSOD-A182P乳液的酶活力保留程度高于含有野生型MnSOD的乳液,表明MnSOD-A182P确实具有更好的稳定性,能够耐受该乳液配方中的各种成分,在日化领域有广泛的应用前景。