卵子发生过程是昆虫繁衍及种群维持的关键生理过程。昆虫卵子发生将依次经历前卵黄生成期、卵黄生成期、卵壳生成期、及排卵和受精期等发育阶段。昆虫卵壳主要成分为蛋白质,由卵巢组织中的特殊分泌型细胞—滤泡上皮细胞,于卵壳生成期分泌附着在卵细胞表面的一个复杂胞外结构层。昆虫卵壳包括外层卵壳层和内层卵壳层(也称为卵黄膜层)两个主要的结构层,行使保护胚胎免受机械损伤和微生物侵染、防止水分丧失、维持气体交换、参与胚胎极性形成等重要功能。卵壳结构及其功能是昆虫生物学研究的热点之一。昆虫间卵壳蛋白的差异性,使得卵黄膜层结构蛋白(也称为卵黄膜蛋白)的研究长期局限于双翅目昆虫中,这种研究状态与卵壳多样性及生理功能重要性不相匹配。此外,昆虫胞外卵壳结构层的分泌组装过程；不同昆虫卵黄膜蛋白的构成、序列特征、序列的保守性及差异性；卵黄膜蛋白编码基因的表达特征、编码基因在基因组中的分布特征等都是一系列未知的生物学问题。本研究以鳞翅目模式昆虫-家蚕为研究对象,构建家蚕卵巢及蚕卵蛋白质图谱,通过比较蛋白质组学技术,分析卵子发生过程中卵巢及蚕卵的蛋白质组成及变化情况,鉴定获取发育时期相关的特征蛋白质。筛选家蚕及其它鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白及其编码基因,比较分析不同昆虫卵黄膜蛋白序列的保守性与差异性,并以家蚕卵黄膜蛋白-BmEP80为代表,结合相应的蚕卵致死突变体(ι-em),对鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白进行功能研究。主要获得如下研究结果：1、家蚕蚕卵和卵巢组织蛋白质组学分析昆虫卵子发生的基本功能单元为滤泡。在家蚕中,滤泡发育主要在蛹期完成,家蚕滤泡发育具有典型的次序性(也称为不同步性),即卵巢管中依次排列着不同发育阶段的滤泡,相邻滤泡发育间隔2-2.5h。本研究获取家蚕Dazao (野生型)化蛹7天卵巢组织、Dazao24h和48h受精卵、Dazao24h和48h非受精卵、滞育性Dazao受精卵、非滞育性Dazao受精卵、Dazao蚕卵卵壳、Dazao蚕卵内容物、以及家蚕小卵突变种(emi、sm、sm-2)化蛹7天卵巢组织,抽提蛋白质,经双向电泳分析,获取相应的双向电泳图谱。选取Dazao化蛹7天卵巢组织及Dazao24h受精卵的蛋白质双向电泳图谱,挖取丰度较高的蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定分析,分别鉴定获得33和42个不同的蛋白质,构建了家蚕蛹期卵巢组织及家蚕早期胚胎期蚕卵的蛋白质图谱。比较蛋白质组学分析Dazao24h和48h受精卵、及24h和48h非受精卵卵蛋白的双向电泳图谱,获得与蚕卵受精及早期胚胎发育相关的5个特征蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定发现,其中两个特征蛋白质为本研究在家蚕中首次鉴定获得,分别命名为BmEP80和Peritrophin-like27。 BmEP80合成于家蚕蛹期卵巢组织,之后存储于蚕卵中,蚕卵受精后BmEP80将消失。基于上述特征,推测BmEP80为家蚕内层卵壳结构蛋白。Peritrophin-like27含有三个Chitin binding Peritrophin-A结构域,于蚕卵受精48h后出现。推测家蚕早期胚子形成过程中,Peritrophin-like27可能作为一个结构蛋白参与某一组织或器官的形成。本研究通过比较蛋白质组学分析,获得滞育性受精卵与非滞育性受精卵卵蛋白的差异蛋白点,以及家蚕Dazao与家蚕小卵突变种卵巢组织蛋白质的差异蛋白点。上述差异蛋白质的鉴定与分析,对家蚕蚕卵滞育的形成以及家蚕小卵突变的研究提供了一些参考数据。2、家蚕BmEP80表达特征及功能研究家蚕蚕卵比较蛋白质组学分析显示,BmEP80疑似为家蚕内层卵壳蛋白,基因组基因预测信息显示BmEP80为单外显子基因编码的大分子量蛋白质。本研究对BmEP80及其编码基因的表达模式和功能开展相关分析。基因表达特征显示：BmEP80特异表达于家蚕蛹中后期的卵巢组织；不同发育时期滤泡检测结果显示,BmEP80表达于卵黄生成期后期至卵壳生成期早期的滤泡中,高量表达区间为-5～+10；原位杂交结果显示,BmEP80由滤泡上皮细胞所表达,卵细胞不表达BmEP80。Western blot检测蛋白表达特征显示,BmEP80开启表达于--10期滤泡；蚕卵不同组分蛋白质双向电泳分析显示,蚕卵中的BmEP80分布于卵壳结构中,而蚕卵内容物无此蛋白；家蚕蚕卵卵壳免疫组化检测结果显示,BmEP80定位于一个狭窄的卵壳结构层中,该结构层位于小脊柱层和卵黄膜层之间。上述结果证实BmEP80为家蚕一个大分子量内层卵壳蛋白编码基因,BmEP80基因及蛋白的表达模式均符合昆虫内层卵壳蛋白的特征。本研究使用RNA干涉方法研究家蚕BmEP80的功能,BmEP80siRNAs注射干涉后,蛹期卵巢组织中该基因表达受到瞬时抑制,相应蚕卵卵壳中BmEP80蛋白含量下降约20%。BmEP80RNA干涉不影响滤泡后续发育过程,以及个体化蛾、交配产卵行为。卵壳中BmEP80降低使得蚕卵在胚胎发育过程中发生三角形凹陷,表明BmEP80作为家蚕内层卵壳层的一个结构蛋白,行使维持卵壳结构完整的功能,并且推测与蚕卵卵壳保水功能相关。3、鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白编码基因预测、表达特征及功能域分析昆虫卵黄膜蛋白的研究局限于双翅目昆虫。双翅目昆虫之外,仅在家蚕中鉴定报道过一个卵黄膜蛋白-BmVMP30。序列比对分析显示BmVMP30与双翅目昆虫卵黄膜蛋白不存在序列相似性。黑腹果蝇卵黄膜蛋白编码基因(VM26Ab, VM26Ac和VM26Aa)戎簇分布于2号染色体左臂26A位点处,基于对此特征的思考,本研究在BmEP80侧翼基因组序列上鉴定出3个预测卵黄膜蛋白编码基因,表明家蚕基因组中也存在类似的卵黄膜蛋白编码区。该区域中预测卵黄膜蛋白编码基因依次命名为：BmVMP25(-)、 BmVMP23(+)、BmEP80(+)、BmVMP30.1(+)。基因表达特征分析结果显示,BmVMP25、BmVMP23及BmVMP30.1均表现为蛹期卵巢组织特异表达,并且表达于卵壳生成期早期之前的滤泡。预测基因的表达模式符合昆虫卵黄膜蛋白编码基因的表达特征。烟草天蛾、帝王蝶、红带袖蝶基因组测序公布后,本研究进行tBlastn检索分析,发现已测序鳞翅目昆虫基因组中均存在卵黄膜蛋白编码区域,编码区域内分别鉴定到卵黄膜蛋白编码基因4个、3个和4个,并且基因排列方式相一致,即第一个预测基因由负义链编码,之后预测基因由正义链编码。本研究揭示卵黄膜蛋白编码基因成簇排布特征在鳞翅目昆虫和双翅目昆虫间是保守的。基于序列差异性,本研究将己鉴定鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白分为三类：Group Ⅰ-Ⅲ。Group Ⅰ中的卵黄膜蛋白C末端存在一个保守的疏水性基序(35aa),将其命名为VM结构域。鳞翅目昆虫VM结构域存在两个保守的半胱氨酸残基(CX7C),并且半胱氨酸残基处存在非经典氧化还原位点(CXXS、SXXC).本研究首次证明VM结构域在昆虫间的保守性,推测昆虫内层卵壳结构层在组装形式上存在一致性,即通过分子间二硫键进行交联组装。鳞翅目与双翅目昆虫VM结构域序列比对分析显示,2号位半胱氨酸残基高度保守,1号位半胱氨酸残基保守性次之,双翅目昆虫VM结构域中3号位半胱氨酸残基在鳞翅目昆虫VM结构域中不存在。推测昆虫VM结构域正常功能行使依赖于基序的疏水性、CX7C残基、及非经典氧化还原位点,而对氨基酸残基序列保守性要求不高。4、家蚕蚕卵致死突变体(ι-em)突变机理研究家蚕ι-em突变体为一份遵循伪母性遗传的蚕卵卵壳突变致死隐性突变体,纯合型雌雄个体(ι-em/ι-em)生活史正常,但雌个体(ι-em/ι-em)产下蚕卵将在1h内完全失水溃死。蚕卵表型特征暗示该突变体为内层卵壳蛋白相关突变体,且突变与蚕卵卵壳的保水功能相关。为比较ι-em/ι-em和+/ι-em个体间卵壳蛋白构成差异,本研究获取ι-em/ι-em个体和+/ι-em个体成熟未受精卵,分离卵壳蛋白经双向电泳发现,ι-em/ι-em个体分离卵壳蛋白样品中缺失一个～90kDa高丰度卵壳蛋白,参考Dazao卵壳蛋白双向电泳图谱发现,缺失卵壳蛋白疑似为BmEP80.本研究使用BmEP80抗体,经Western blot实验证实ι-em突变体卵壳中缺失的高丰度卵壳蛋白为BmEP80.此外,ι-em突变体卵巢组织中不表达BmEP80mRNA,表明BmEP80为ι-em突变体的候选基因。本研究使用基因组PCRs、反向PCRs、基因组定量PCRs及Southern blot调查7-em突变体基因组中BmEP80位点结构特征。检测结果显示ι-em/ι-em基因组中,BmEP80位点处～2kb序列被一个～96.3kb的染色体大片段所替换,该～96.3kb染色体大片段包含三部分序列,依次为D-region1(-3.9kb,正方向重复)、iD-region2(-86.7kb,反方向重复)和一个反转录转座子Qian (～5.7kb)。上述染色体片段重复事件涉及8个基因,依次为BmVMP23、BmEP80、Gene1、Gene2、Gene3、 Gene4、Gene5和cJHBP。Gene1～5在此过程中完整的重复一次；cJHBP基因第五外显子的部分序列被重复一次；表达特征检测结果显示Gene1～5及cJHBP在+/ι-em和ι-em/ι-em个体间表达差异不显著,表明它们与ι-em突变体的卵致死表型无关。基因组中基因拷贝数的增加会使得基因出现冗余,其中一个拷贝就会在后续的进化过程中积累突变,进而可能在基因组中产生具有新功能的基因。Gene1-5在ι-em/ι-em基因组中的完整重复一次,为新功能基因的进化产生提供了序列基础。BmVMP23和BmEP80预测为家蚕卵黄膜蛋白编码基因。ι-em突变体基因组中,BmVMP23基因的3’端下游序列被D-region1所替换,造成BmVMP23mRNA聚腺苷化位点缺失。聚腺苷化位点缺失使得mRMA转录或稳定性受影响,使得BmVMP23mRNA在ι-em/ι-em个体卵巢组织中仅微量存在。预测显示BmVMP23不存在信号肽序列,为非分泌型蛋白,BmVMP23不会被分泌进入胞外卵壳结构,由此推测(?)BmVMP23基因的破坏对胞外卵壳结构不产生影响,与ι-em蚕卵突变表型无关。BmEP80在ι-em基因组中不完整重复一次,两个拷贝均缺失5’端上游序列及ORF前160bp序列。BmEP80基因被破坏使得ι-em/ι-em个体卵巢组织中不表达该基因,相应蚕卵卵壳中缺失BmEP80。结合BmEP80功能研究结果推测,BmEP80缺失使得家蚕卵壳结构层中低电子密度均匀层(等同于果蝇及烟草天蛾卵壳的蜡质层,行使保水功能)形成受到影响,造成内层卵壳结构完整性及保水功能被破坏,导致蚕卵产后快速失水,形成ι-em突变体蚕卵失水凹陷致死表型。本研究在ι-em/ι-em基因组BmEP80位点处鉴定获得一个家蚕特有的LTR型反转录转座子,命名为Qian。对ι-em/ι-em基因组结构特点分析后,本研究提出Qian介导染色体片段重复事件的模型,命名为非法匹配DNA修复模型,对ι-em突变过程进行了模拟重现。证明反转录转座子在动物基因组重构中发挥作用,是动物基因及基因组进化的动力之一。