肝细胞癌(以下简称肝癌)是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,每年约有667000个新发病例,并且在中国是第二大导致死亡的癌症。肝细胞癌的高死亡率主要是与其高的术后复发率有关,约有75%的患者术后会出现肝内或肝外的转移。近年来,随着影像学的发展,肝癌术后复发的早期诊断率有所提高,但其昂贵的检查费用,仍不适合作为常规的频繁检测项目。因此寻找能判断肝癌早期复发转移的生物学标志物,预测肝癌复发的风险变得迫在眉睫。AMACR和galectin-4这两种蛋白已经被证实与多种肿瘤的发生发展相联系,我们前期的蛋白质组学研究也发现这两种蛋白与肝癌早期复发转移有关,但是查阅相关文献并没有发现其有关的临床报道,并且它们对肝癌复发转移的作用机制也不得而知。目的:1、检测AMACR和galectin-4蛋白在肝癌组织中的表达,结合临床病理等资料,评价其作为预测肝细胞癌术后早期复发转移风险的分子标志物的能力;2、评价AMACR和galectin-4两种蛋白联合作为肝细胞癌术后复发转移标志物的临床诊断能力;3、通过在体和体外实验阐明AMACR和galectin-4蛋白影响肝细胞癌侵袭转移的作用机制。方法:1、分别选取术后早期复发,晚期复发及未复发病例行Q-PCR检测各组肝癌组织中AMACR m RNA水平。取158例肝癌组织构建组织芯片,免疫组化检测AMACR蛋白表达水平,分析各临床病理参数与AMACR蛋白表达量关系,评价AMACR蛋白作为判断肝细胞癌术后早期复发转移标志物的潜能。2、分别选取术后早期复发,晚期复发及未复发病例行Q-PCR、WB检测各组galectin-4的m RNA和蛋白水平。取201例肝癌患组织构建组织芯片,免疫组化检测galectin-4蛋白表达水平,分析比较临床病理参数与galectin-4的表达量的关系。3、ELESA实验检测肝癌患者血清中AMACR和galectin-4的含量,利用Logistic回归分析绘制受试者工作特征曲线,并计算最佳诊断临界值及其相对应的敏感度和特异度,评价该联合标志物的诊断价值。4、利用pc DNA3.1质粒载体分别构建稳定高表达AMACR、galectin-4肝癌细胞株以及沉默表达AMACR、galectin-4的肝癌细胞株,Transwell实验检测各细胞株转移和侵袭能力;裸鼠皮下成瘤实验评价AMACR和galectin-4蛋白在体内对肿瘤的影响;定量蛋白质组实验对高表达和敲除galectin-4的稳定细胞株进行比较定量分析,展现由galectin-4引起的肝癌细胞的蛋白质组表达差异谱,进一步探讨galectin-4对肝癌细胞转移和侵袭作用机制的影响;结果:1、Q-PCR结果显示AMACR在早期复发转移的肝细胞癌中在m RNA水平上表达明显下降(P=0.004);组织芯片检测发现AMACR蛋白低表达与AFP血清水平(P=0.012),肿瘤数目(P=0.005),区域淋巴结转移(P=0.042),肿瘤包膜(P=0.026)以及门静脉癌栓(P=0.049)相关。158例肝癌术后生存率单因素分析发现:术中腹水、肿瘤大小、肿瘤包膜完整度、肿瘤分化程度、门静脉癌栓以及AMACR蛋白表达量与术后生存时间相关;多因素分析显示,AMACR蛋白可以作为预后的独立判断因素(P=0.031)。Kaplan-Meier分析结果示:低表达AMACR蛋白的患者其中位生存期较高表达组短(log-rank,P<0.001)。2、Q-PCR和WB结果显示galectin-4在早期复发转移组的肝细胞癌中m RNA水平及蛋白水平表达都有明显的下降。组织芯片检测发现galectin-4蛋白低表达与肿瘤大小(P=0.036),组织的低分化(P=0.011),微血管侵犯(P=0.004)以及TNM处于更晚期(P=0.015)相关。201例肝癌术后生存率单因素分析发现:肿瘤大小、肿瘤包膜完整度、肿瘤分化程度、门静脉癌栓,TMN分期以及galectin-4蛋白表达量与术后生存时间相关;多因素分析显示galectin-4是判断肝细胞癌术后总生存期(P=0.002)的独立因素。Kaplan-Meier分析结果表明galectin-4低表达患者较高表达患者具有更高的转移复发率(log-rank,P<0.001)及更短的总生存期(log-rank,P<0.001)。3、在早期复发转移的肝癌患者中,血清AMACR及galectin-4含量要明显高于晚期复发转移患者(P<0.05)。以165.5 pg/ml作为AMACR诊断早期复发转移肝癌的临界值其灵敏度和特异度分别为0.407及1。同样,将3367.5 pg/m L作为galectin-4诊断早期复发转移肝癌的临界值其灵敏度和特异度分别为0.852及0.524。两种蛋白的曲线下面积分别是0.703(P=0.025)和0.712(P=0.019)。将两者结合绘制ROC曲线得到其曲线下面积为0.799(P<0.000),诊断价值明显提升。4、Transwell实验发现,下调galectin-4蛋白表达量能显著增加肝癌细胞株的转移和侵袭能力;下调AMACR蛋白的表达量在体外对肝癌细胞的转移侵袭能力没有明显影响。裸鼠皮下成瘤实验示:低表达galectin-4蛋白的肝细胞癌其肿瘤生长速度较高表达galectin-4蛋白的肝细胞癌明显增快(P=0.0496)。而AMAR蛋白对皮下肿瘤生长的影响不明显。蛋白质组学分析显示:改变肝癌细胞株中galectin-4蛋白表达量能引起127种蛋白表达谱产生较大差异,其多数蛋白参与肝癌细胞的转录翻译以及脂肪酸、氨基酸代谢等生物学过程。结论:1、AMACR和galectin-4蛋白肝癌组织中的低表达可能与术后早期复发相关,可以作为肝细胞癌术后早期复发转移的预后标志物;2、联合检测AMACR和galectin-4血清水平能明显提高肝细胞癌术后早期复发转移的诊断能力;3、galectin-4蛋白可能影响肝癌细胞氨基酸及脂肪酸代谢等生物学过程,其表达量的下降会促进肝癌细胞的转移侵袭能力。