牛奶作为一种理想的天然食物,由于其营养丰富,容易消化吸收,被喻之为“白色血液”。随着牛奶消费量的增加,牛奶中的农兽药残留以及毒素等有害物质也越来越受到人们的关注,如抗生素、激素、真菌毒素等。近几年的报告显示,氯霉素、雌二醇和黄曲霉毒素M1在牛奶中的检出水平较高,对人体的健康产生了极大的威胁。因此需要开发出快速高灵敏的检测方案以保障消费者的身体健康。酶联免疫法（ELISA）作为一种简单、快速的检测方法,已经被广泛应用于各类污染物检测中。但随着检测要求越来越高,传统的ELISA可检测信号少,已经不能满足高灵敏的检测要求。而且,传统的ELISA依赖于辣根过氧化物酶,无法实现多信号的输出。本论文以金纳米颗粒（Au NPs）为载体,抗体作为目标捕获单元,寡核苷酸作为信号放大单元,制备了双功能检测探针。并基于免疫竞争法的原理,分别结合核酸外切酶III（ExoⅢ）和8-17 DNA拟酶（8-17DNAzyme）介导的等温核酸扩增技术,实现了牛奶中氯霉素（CAP）、17β-雌二醇（17β-E2）和黄曲霉毒素M1（AFM1）的快速高灵敏检测。（1）开发了一种基于间接竞争免疫法和ExoⅢ辅助的等温核酸扩增技术的综合方法,定义为Exo III辅助的核酸扩增荧光免疫法（EA-NAFIA）,用于检测牛奶中的CAP。首先筛选核酸序列用于ExoⅢ辅助的等温核酸扩增,然后通过盐老化法制备了抗体和DNA修饰的Au NPs作为双功能检测探针,抗体用于捕获靶标,DNA用于实现信号放大。在优化条件下,该方案获得了0.01 ng/L-5 ng/L的线性检测范围,检测限低至0.001 ng/L。与链霉素、卡那霉素、庆大霉素、甲砜霉素交叉反应较小,并成功应用于脱脂牛奶中的CAP检测,检测时间为3 h,回收率在81%-113%。（2）基于8-17 DNAzyme的等温核酸扩增技术被用于构建第二种荧光免疫分析方案。其中检测探针Au NPs-抗体-DNA是通过冷冻法结合盐老化法制备的,冷冻法的引入优化了探针上抗体和寡核苷酸的吸附比例,增加了Au NPs上负载的DNA数量,从而实现了更加高效的信号放大。在优化条件下,该方案具有较宽的线性检测范围（0.1ng/L-1×10~6 ng/L）,检测时间为1 h。在全脂牛奶中的回收率良好（86%-104%）,与其他抗生素交叉反应率低。（3）实现了牛奶中三种小分子污染物（CAP、17β-E2、AFM1）的同时检测。8-17DNAzyme作为催化拟酶结构放大信号输出,与以辣根过氧化物酶为催化因子的传统ELISA相比,这种基于8-17 DNAzyme的检测方案可以实现多信号输出。在该方案中优化了包括抗原包被浓度、探针浓度、离子浓度和修饰荧光素种类等关键实验参数。在优化条件下,CAP、17β-E2、AFM1的标准曲线显示出良好的线性关系,线性范围为0.3ng/m L-3000 ng/m L、3 ng/m L-3000 ng/m L、0.003 ng/m L-3 ng/m L。