研究背景:　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,是引起急、慢性肝炎的主要病原体。全世界约有3.5亿感染者,每年大约有100万患者死于慢性乙型肝炎(CHB)的并发症:肝硬化、肝癌、终末期肝病。尽管各种抗病毒药物的出现,给肝炎治疗带来曙光,但由于耐药株的不断出现,对HBV现症患者的治疗还远不能达到理想的疗效。究其因为,可能与HBV存在的准种现象有关。因此,HBV准种在病毒逃避宿主免疫监视、病毒持续存在及耐受抗病毒治疗中的重要地位正日益受到重视。　　 病原微生物长期点突变的积累形成不同的基因型和血清型,但是,对于感染单一病原体的具体患者,在较短时间内病原微生物核酸的突变则造成体内同时存在基因序列有微小差别的种群。种群的各个成员之间差别程度一般不会超过核苷酸总长度的2-5％,这种差别不至于构成病原体不同的基因型或血清型,但的确存在基因序列的差别,这种现象就称为准种(quasispecies)。准种是病原微生物存在的普遍现象和规律。HBV的生活史是先生成前基因组RNA,以此为模板,通过逆转录过程复制子代基因组序列。由于逆转录酶不具有3ˊ-5ˊ校对功能,子代的HBV基因组与模板比较,存在一定的变异。此特性决定了HBV基因组的高突变性及异质性病毒群体存在的可能,即在逆转录过程中可能产生了准种群。现在研究准种的实验方法一般都是应用PCR技术进行基因扩增以后,再进一步作分子生物学技术分析。研究的主要技术和方法包括限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、单链构象多态性(single strand conformational polymorphism,SSCP)、温度梯度凝胶电泳(temperatures gradient gel electrophresis,TGGE)、凝胶转移分析、基因克隆与基因测序等。　　 HBV准种特点的研究对于理解CHB患者临床耐药的形成过程和临床特点具有很大的帮助和意义。从准种特点来看,任何CHB患者血液中的HBV都是以不同种群存在的,种群的性质和特点,主要取决于病毒群不同组分的复制能力和机体的免疫力之间相互作用最终达到的一种平衡的结果。但是,开始应用核苷类似物(Nucleotide analogues,NA)进行抗病毒治疗时,这种平衡就被打破了,在药物选择的作用下,形成了新的平衡,各种病毒种群所占的相对比率也进行了新的调整。优势种群和不同的劣势种群存在着一种转换,称之为种群的的漂变(shift)。　　 随着抗病毒药物的广泛使用,耐药性问题日趋严重,进行合理有效的抗病毒治疗是当务之急。我们必须将HBV准种与抗病毒药物敏感性问题联系起来,根据HBV准种检测结果来指导抗病毒药物的选择和评价抗病毒的疗效应答。　　 研究目的:　　 本研究收集了4例多种(3种或3种以上)抗病毒药物耐药的慢性乙型肝炎病例。应用多克隆基因测序的方法,通过对其HBV全基因及各ORF的碱基和氨基酸序列的分析,探讨多药物耐药CHB患者HBV准种和变异特点。并结合临床资料,分析HBV准种和变异与多药物耐药的关系,以期发现新的耐药位点。　　 材料和方法:　　 收集4例经过3种以上抗病毒药物治疗,发生耐药的CHB患者的血清。　　 1.采用实时荧光定量PCR法检测血清HBV DNA载量:血清HBV DNA载量以拷贝/毫升表示,试剂盒的检出限度为500拷贝/毫升。实验重复三次,结果取平均值。　　 2.HBV全基因组扩增、克隆及筛选:采用长片段PCR方法一次扩增HBV全基因组并克隆入pMD20-T载体,PCR筛选阳性克隆。病例1、2、3和4分别选取22、22、20和20个阳性克隆。　　 3.HBV全基因组测序:阳性克隆提取质粒DNA,设计测序引物,分5段测序,然后用序列拼接软件Sequencer,将各段DNA序列拼接得到HBV全基因组。　　 4.HBV DNA的生物信息学分析:将获得的HBV DNA序列用DNAStar进行比对和分析,探讨多药物耐药的CHB患者HBV准种和变异特点。　　 结果:　　 1.4例患者全部成功扩增出HBV全长并多克隆测序得到HBV DNA全序列。　　 2.全部HBV基因型均为B型,血清型均为adw型。　　 3.4例患者的全基因碱基序列同源性分别为98.5-99.8％、98.3-99.7％、98.2—99.7％和98.8—99.7％；preC/C区的碱基序列同源性分别为97.5-100％、97.1—100％、97.3-99.8％和98.4-100％；全S区的碱基序列同源性分别为98.4—99.8％、98.7-99.9％、97.7—100％和98.3-99.8％；P区的碱基序列同源性分别为99.2—99.8％、99.1-99.8％、98.7-100％和99.1-100％；X区的碱基序列同源性分别为98.0-100％、97.3-100％、98.7-100％和99.1-100％。　　 4.HBV核酸序列和氨基酸序列的遗传进化树分析显示来自同一患者的HBV序列被归纳到同一分支中。　　 5.病例1、2和3的HBV DNA序列均发现大片段缺失现象,尤其病例2的大片段缺失现象发生频率高。　　 6.病例1和病例4的nt1896G-A终止突变频率高,分别为19/22和20/20；病例1的全部克隆(22个)均检测到nt1762+nt1764双突变,病例2的nt1896G—A终止突变和nt1762+nt1764双突变出现频率各为1/20。　　 7.病例1、3、4均检测出rtL180M和rtM204V/I耐药突变,rtL180M变异发生频率分别为19/22、18/20、19/20；rtM204V/I变异发生频率分别为19/22、20/20和20/20。　　 8.RT区氨基酸序列分析发现未报道的高频率突变,如rt91、rt222、rt271等。S区的195位氨基酸出现高频率的I→M变异,C区的135位氨基酸出现高频率的P→Q变异。　　 结论:　　 1.慢性乙型肝炎患者体内的HBV以准种形式存在并贯穿于HBV整个基因组。　　 2.不同患者的HBV准种呈现一定的个体特异性。HBV核酸序列和氨基酸序列的遗传进化树分析显示来自同一患者的HBV序列全部被归纳到同一分支中,不同患者来源的HBV序列在遗传进化树中归属于不同分支,没有相互交叉现象,而且不同患者的各ORF的遗传距离有所不同；来源于不同患者的HBV在某位点上编码的氨基酸是不同的,但来源于同一患者的不同克隆在同一位点的编码氨基酸是相同的。这种个体特异性可能与HBV所处的不同宿主环境有关。　　 3.多药物耐药患者的HBV准种已发生了变迁。和一般情况下,HBV的S、C、P区基因的差异性依次增高有所不同,本研究中的多药物耐药患者都是P基因差异小于S、C基因。　　 4.对4例耐药患者的各ORF编码的氨基酸进行分析后,发现除已经确认的耐药相关突变rtL180M和rtM204V/I外,还有一些其他高频率的变异位点,可能与多药物耐药有关。