论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种猪繁殖障碍和呼吸道症状的传染病,对养猪业造成极大危害,控制这种传染病是生产上急需解决的问题,控制本病的关键之一在于生产高效的疫苗,但由于PRRSV变异很大,给高效疫苗的开发造成很大困难。本课题旨在从河北省本地猪场分离毒株,通过与已发表毒株的核苷酸和氨基酸序列进行对比,了解河北PRRSV的分子流行病学特点。并且以本地分离株为基础,克隆表达其诱导机体产生中和抗体的ORF5基因,构建成熟的原核表达系统,为今后基因工程疫苗的生产打下基础。本研究从河北省各地送检的六份疑似PRRS感染病料,经RT-PCR诊断试剂盒检测,阳性病料经处理后用Marc-145细胞增殖培养,其中沧州市送检病料接种Marc-145细胞后经过4代盲传后,开始出现细胞病变(CPE),经RT-PCR鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因片段,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化大肠杆菌Top10,阳性重组质粒进行序列测定与分析。通过与国际代表毒株及国内主要毒株比较分析,发现河北PRRS HB-3(cz)株与北美洲株亲缘关系较近,而与欧洲株关系较远;HB-3(cz)株与所有其它河北毒株序列同源性很高,疏水性、抗原性基本一致;06年夏以来河北省流行毒株亲缘关系很近。设计另一对引物(P3/P4)从重组载体pGM-ORF5中扩增出缺失了N端28个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,构建ORF5基因的原核表达质粒;将重组质粒转化Rosetta-DE3,经IPTG的诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为42.0kDa的目的蛋白,经Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,具有免疫原性;并对表达条件进行了优化。这为进一步研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。