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苯广泛存在于日常生活和工业生产中,是人类致癌物。长期慢性苯暴露主要影响机体的造血功能,其毒性机制主要是苯的酚类、醌类等代谢产物对骨髓造血细胞的损伤及造血微环境的破坏,导致骨髓抑制,进而引起粒细胞减少症,再生障碍性贫血、白血病等。我国工业生产规模庞大,暴露苯的人群众多,苯中毒的遗传易感性与生物标志物的研究一直是苯中毒预防领域的热点与重点问题。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)是磷酸戊糖代谢途径的初始酶和关键酶,能够催化葡萄糖-6-磷酸脱氢,使辅酶II (NADP+)还原为还原型辅酶II (NADPH),在谷胱甘肽还原酶的催化作用下,NADPH使氧化型谷胱甘肽(GSSG)转化为还原型谷肮甘肽(GSH),保护细胞免受氧化损害。G6PD缺陷是全球最常见的一种不完全显性伴性遗传缺陷,平时不发病,无症状,常因暴露于强氧化剂(食新鲜蚕豆或药物)发病,发病通常表现为急性溶血性贫血。全世界大概有4亿人患有G6PD缺乏症,约5%的人受累。本课题首先建立小鼠造血毒性模型,通过对苯中毒小鼠和正常小鼠外周血清中差异性多肽的检测,发现在苯中毒小鼠血清中差异性表达的多肽G6PD；进而通过体外构建G6PD低表达K562细胞株,研究G6PD对苯醌细胞毒性的调控,探讨G6PD缺陷细胞株是否对苯醌细胞毒性的易感性增加,是否通过抑制GSH合成,增加氧化产物累积,造成氧化损伤增加；最后利用G6PD低活性小鼠,研究G6PD低活性对苯造血毒性的影响,探讨G6PD低活性小鼠是否对苯的造血毒性易感性增加。1.小鼠苯暴露的血清多肽组学研究以玉米油为溶剂,皮下注射的方式染毒建立小鼠造血毒性模型,苯染毒浓度分别为150mg/(kg · d),300mg/(kg · d), 。染毒结束后处死小鼠,分析小鼠脏器系数、外周血血常规、造血干细胞比例,研究苯对小鼠的一般毒性和造血毒性。通过弱阳离子交换柱(WCX)磁珠分离捕获小鼠血清多肽后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测,使用数据分析软件BioworksBrowser 3.3.1 SP1进行检索,分析鉴定出差异性表达的多肽。染毒组小鼠与对照组相比肾体比显著升高,胸腺系数显著降低；苯暴露组小鼠骨髓中造血干细胞比例显著降低,并且外周血中白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量和血小板均显著降低。结果表明苯暴露小鼠产生了造血毒性。苯中毒小鼠和对照小鼠外周血清中有7个多肽峰的表达存在显著性差异,其中鉴定出的两个多肽分别为G6PD和热休克蛋白,而G6PD在苯中毒小鼠中表达上调,检测G6PD蛋白在小鼠肝脏中的表达,与血清表达趋势一致,苯中毒组G6PD蛋白表达明显升高,提示此蛋白可能可能是小鼠苯中毒的血清标志物,参与苯的造血毒性作用。2.体外构建G6PD低表达K562细胞株,研究G6PD对苯醌细胞毒性的调控本部分首先设计了针对G6PD基因的叁个靶点siRNA及一个阴性对照siRNA,并通过三质粒包装系统将其包装成慢病毒后感染K562细胞构建G6PD低表达K562细胞株(K562-G6PD△)和阴性对照细胞,RT-PCR法检测感染后细胞内G6PD mRNA表达量。用0.10.20μmoI/L的苯醌处理K562-G6PD△和阴性对照细胞,通过RT-PCR(?)WB检测细胞中G6PD mRNA和蛋白的表达,比色法检测细胞中G6PD酶活性,利用荧光探针标记和比色法检测并计算细胞中ROS及NADPH/NADP、GSH/GSSG相对水平,通过MTT实验、彗星实验、细胞凋亡、细胞周期研究细胞增殖抑制情况、细胞的DNA损伤、细胞凋亡率及周期分布变化。RT-PCR结果显示K562一G6PD△细胞中G6PD mRNA目对表达量较阴性对照细胞降低了87%,表明G6PD低表达的K562细胞株构建成功。随着苯醌浓度的增加,K562.G6PD△和阴性对照细胞中G6PD基因表达均显著上调,且呈剂量-反应关系,此外,在0、10、20μmol/L苯醌作用下K562-G6PD△细胞中G6PD mRNA相对表达最均显著低于阴性对照细胞。WB结果显示苯醌暴露后G6PD蛋白在K562-G6PD△和阴性对照细胞中的表达趋势与G6PD mRNA表达趋势一致。G6PD酶活性在K562-G6PD△和阴性对照细胞中均随着苯醌浓度增加而升高,且K562-G6PD△均明显低于阴性对照细胞。比色法结果显示K562-G6PD△细胞暴露于各浓度的苯醌时NADPH/NADP和GSH/GSSG比值均明显低于阴性对照细胞。K562-G6PD△细胞内ROS相对水平随苯醌浓度的增加而升高,且K562-G6PD△细胞内ROS水平均明显高于阴性对照细胞。MTT结果显示各浓度苯醌暴露后K562-G6PD△细胞增殖率均明显低于阴性对照细胞。彗星实验结果显示暴露于20μmol/L的苯醌时K562-G6PD△细胞尾DNA含量及Oliver尾矩均明显高于阴性对照细胞。流式细胞仪检测结果显示暴露于20μmol/L的苯醌时K562.G6PD△细胞凋亡率显著高于阴性对照细胞,暴露于10μmol/L和20μmol/L的苯醌时K562-G6PD△细胞G2期细胞数显著高于阴性对照细胞。以上结果表明苯醌暴露时G6PD缺陷的细胞可能不足以产生足够的NADPH以维持GSH的水平,因此K562-G6PD△暴露于苯醌时ROS相对水平升高,进而K562-G6PD△细胞增殖率明显降低、DNA损伤增加、细胞凋亡率升高及细胞周期G2期阻滞,G6PD缺陷可以增加苯醌对K562细胞的氧化损伤作用。3.利用G6PD低活性小鼠,研究G6PD对苯造血毒性的调控本部分首先构建了G6PD低活性的小鼠(G6pdxa-mlNeu), PCR法鉴定小鼠基因型,比色法检测小鼠肝脏中G6PD酶活性。G6pdxamlNeu和正常小鼠苯染毒浓度分别为40mg/(kg·d)、80mg/(kg·d),160mg/(kg · d)。染毒结束后分析小鼠体重、脏器系数、外周血血常规及DNA损伤情况。PCR鉴定结果表明小鼠基因型为雄性缺陷型,且G6pda-mlNe/Y小鼠肝脏中G6PD活性明显低于正常小鼠,为正常小鼠的61%。苯浓度为40、80、160 mg/(kg·d)时G6pda-mlNeu/Y小鼠脾体比较正常小鼠明显降低,苯浓度为0、40、80 mg/(kg·d)时G6pa-mlNeu/Y小鼠肾体比较正常小鼠明显降低。血常规结果显示暴露于80、160mg/(kg·d)的苯时G6pda-mlNeu/Y小鼠外周血白细胞计数明显低于正常小鼠,且尾DNA%、Oliver尾矩和尾长均明显高于正常小鼠。G6pda-mlNcu/Y小鼠外周血白细胞计数明显低于正常小鼠,尾DNA%、Oliver尾矩明显高于正常小鼠表明G6PD低活性加重小鼠对苯造血毒性及氧化损伤的易感性。综上,本研究发现苯中毒小鼠血清中G6PD高表达,肝脏中G6PD蛋白高表达,表明G6PD可能参与苯的造血毒性作用；对G6PD低表达的K562细胞株研究表明G6PD缺陷细胞株对苯醌细胞毒性的易感性增加,机制可能是通过抑制GSH合成,增加氧化产：物累积,造成氧化损伤增加；对G6PD低活性小鼠的研究表明G6PD缺陷小鼠对苯造血毒性的易感性增加,机制还有待进一步的研究。本研究在新的研究发现的基础上结合理论的可行性,首次提出开展G6PD缺陷与苯造血毒性易感性与机制的研究,有较好的创新性和社会意义。而且世界上多个国家在新生儿出生时就对G6PD活性进行了检测,未来易感人群的筛检也具有良好的可行性。因此,本研究结果将对G6PD缺陷人群苯作业的危险性提供重要的科学理论依据,可能为苯作业易感人群筛检提供新的生物标志,对于加强职业苯暴露的一级预防有重要意义。