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水产养殖环境是一个具有丰富氮(N)源的N循环系统,而亚硝酸盐(NO2-)是一种存在于养殖水体的毒性物质,过量的NO2-会毒害养殖动物,甚至危害人体健康。养殖水体中亚硝酸盐是如何积累以及如何快速去除,一直是人们关注的热点,也是健康养殖的重点。因此,为了解不同养殖时期水体中参与亚硝酸盐积累与转化的微生物过程,以及细菌菌群动态变化规律及其与水质参数的相互关系。本研究以凡纳滨对虾养殖水体为研究对象,通过功能基因克隆文库和qPCR技术分析养殖水体中参与亚硝酸盐转化的功能基因多样性和丰度;通过高通量测序技术分析养殖水体中细菌群落结构多样性及其动态变化;并探讨了功能基因丰度和细菌群落与水质参数的相互关系。1.不同时期养殖水体中参与亚硝酸盐积累与转化的微生物过程功能基因克隆文库分析得知:养殖水体第40天样品中,膜结合硝酸盐还原功能基因(narG)多样性和丰富度最高,细胞色素cd1型亚硝酸盐还原功能基因(nirS)多样性和丰富度最低;而第131天样品中,narG、周质硝酸盐还原功能基因(rapA)多样性和丰富度最高,周质亚硝酸盐还原功能基因(nrfA)多样性和丰富度最低。narG基因在养殖前后多样性都很高,变化不大;nrfA基因在养殖前后多样性变化很大,从D40到D131多样性变小;archamoA、napA、nirK、nirS等基因多样性从D40到D131有不同程度的增大。NCBI比对结果表明,该养殖水体中的NapA、NarG、NirK、NrfA等功能酶类比较新颖。定量PCR实验结果表明,古菌和细菌的氨氧化功能基因(amoA)在养殖期间处于低丰度水平,而四个反硝化功能基因和nrfA基因丰度维持在相对较高水平(范围在3.73E+02-1.50E+05copies/ngDNA)。其中,napA基因丰度随养殖时间延长基本呈增高趋势,而narG基因丰度则逐渐降低,但普遍高于napA基因;nirK基因丰度在养殖前期(D40和D59)呈上升趋势,而后(D67-D131)逐渐下降,并低于nirS基因丰度,而nirS基因丰度在养殖期间相对稳定;nrfA基因在养殖期间维持在高丰度水平。功能基因定量数据表明该养殖水体中亚硝酸盐积累和转化主要与氨氧化微生物和反硝化微生物有关,氨氧化微生物对亚硝酸盐产生起到一定作用,高丰度的反硝化微生物对硝酸盐和亚硝酸盐去除起到关键作用,而反硝化过程中硝酸盐还原酶基因(narG、napA)与亚硝酸盐还原酶基因(nirS、nirK)的丰度差可能导致亚硝酸盐浓度升高。2.不同时期养殖水体中细菌菌群动态变化16S rRNA基因高通量测序结果表明,7个时间点的19个水样检测到的细菌种群归属于22个门、37个纲、83个目、140个科、271个属,说明该养殖水体中细菌群落具有高度的多样性。拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)是养殖期间主要优势类群,但不同养殖时期的细菌组成在纲、科、属水平上波动较大。此外,高通量测序还检测到低丰度的氨氧化细菌,以及一定丰度的潜在反硝化细菌,与功能基因克隆文库结果较为一致。3.细菌菌群和参与亚硝酸盐转化的功能基因丰度与水质参数的相互关系冗余分析(Redundancy analysis,RDA)表明,细菌菌群主要与溶氧(DO)和温度(T)相关性最大,其次是NH4+、N02-NO3-。值得关注的是,铵态氮(NH4+)浓度波动范围较大,但是对细菌菌群影响却很小。养殖水体中参与亚硝酸盐转化的反硝化功能基因丰度主要与NH4+-N、T和NO3--N相关性最大;不同的水质因子与不同功能基因的相关性不同。本研究初步分析了凡纳滨对虾养殖不同时期养殖水体中参与亚硝酸盐转化的功能基因多样性、丰度及分布,以及细菌菌群动态变化及其与水质参数的相互关系。初步确定了参与亚硝酸盐积累和去除的关键功能基因,同时加深了对养殖水体中细菌菌群多样性及其演替规律的认识,对水产品的食用安全以及人类健康也具有重要意义。