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基因治疗所用载体分为病毒载体和非病毒载体两类。使用病毒载体进行内耳基因转染获得很多进展,比如研究发现成熟豚鼠耳蜗通过腺病毒转染Mathl过表达后发现齿间细胞区、内沟细胞区、Hensen细胞区产生新的毛细胞,并且有听觉神经的轴突伸向新生毛细胞。虽然目前重组病毒是最有效的基因转染载体,但聚合物载体有一些优势(安全性高、易生产、可载较大基因、容易修饰等)使得其成为可能的替代物。非病毒载体主要包括脂质体、阳离子多聚物、树枝状大分子、环糊精、壳聚糖等。
聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)作为阳离子多聚物的一种,已被证明是一种体内外均有效的非病毒载体,并且转染效率远高于其同类物多聚赖氨酸(poly-lysine),原因可能是PEI所具备的“质子海绵效应”所致。
本研究的目的是使用25kDa线性和分枝PEI作为表达绿色荧光蛋白的质粒的载体转染体外培养的新生小鼠基底膜。25kDa线性或分枝PEI与质粒在5%葡萄糖溶液或者PBS溶液中形成纳米粒后,行MTT实验毒性测试、凝胶阻滞实验、透射电镜观察并在293T和PC-12细胞流式检测其转染效果。然后再用其转染基底膜并行荧光镜观察和免疫细胞化学染色。
结果表明,实验获得与文献报道相似的纳米粒。在PBS中制备的L-PEI复合物毒性最低。在较高L-PEI浓度,在PBS中制备的L-PEI复合物毒性小于在葡萄糖溶液中制备的。L-PEI毒性低于B-PEI。由于各种细胞对PEI的敏感程度不同,可能某些细胞在目前使用的转染浓度下生长状态等就已经受到影响,特别是毛细胞。这需要更多的实验测试其毒性。形态观察已经发现,当L-PEI polyplex加倍或3倍时,显微镜下的形态反映出一定毒性。B-PEI polyplex加倍或3倍时毒性则更大。在PBS中制备的L-PEI复合物转染能力最强。L-PEI用量10-14μg/ml(质粒用量4μg/ml),以L-PEI:pDNA(w/w)为2.5在PBS中制备时转染螺旋缘(spiral limbus)部位的细胞(螺旋纤维细胞和/或齿间细胞,具体为哪种不明确)效果较稳定。L-PEI在5%葡萄糖中制备的polyplex转染细胞类型不明,免疫荧光表明,部分表达神经细胞标记。所有部位被转染的结果需要后续实验针对胶质细胞、支持细胞、毛细胞以及其它类型细胞比如上皮细胞和成纤维细胞进行免疫荧光测试以进一步明确。针对螺旋神经节细胞的免疫荧光实验(染神经微丝)表明,确实有螺旋神经节细胞被转染,但数量较少。这可能与培养液中未加入神经营养因子、抗白血病坏死因子等以及体外培养观察时间过长等导致螺旋神经节细胞总量很少有关。如果后续免疫荧光实验表明,确实有支持细胞/毛细胞/两者的前体细胞被转染,那将是首次报道非病毒载体L-PEI既可以转染支持细胞/毛细胞又可以转染螺旋神经节细胞。