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本论文研究内容分为两个部分。
第一部分:药物成瘾性是由于长期药物滥用导致的一种复杂的大脑疾病,现已成为全世界关心的社会和医学问题,其主要特征是一旦成瘾,将经久不衰,很难消失。关于药物的精神依赖至今尚无理想的根治方法,本研究根据即刻早期基因c-fos,junB与药物成瘾的密切关系,深入探讨c-fos与junB基因对药物成瘾作用的影响,进而寻求解决药物精神依赖的有效基因疗法。
本实验主要采用RNAi技术,应用RNA聚合酶Ⅲ中的U6启动子成功构建了靶向c-fos与junB基因的体外转录质粒pKB-GU-shC,pKB-GU-shB以及阴性对照载体pKB-GU。采用Exgen500转染试剂法将各重组干扰质粒瞬时转染至PC12细胞,考察细胞接种数目,细胞融合度,N/P及血清等因素优化得到最佳瞬时转染效率为50%左右。进一步将载体瞬时转染至大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞,通过RT-PCR实验检测c-fos与junB基因的表达情况;同时我们对转染单基因沉默载体的PC12细胞在G418抗性筛选压力下进行稳定筛选,2周左右得到稳定表达细胞株,对其进行了RT-PCR实验。结果表明,与阴性对照组相比,瞬时转染PC12细胞中c-fos与junB的mRNA相对表达量与无干扰质粒pKB-GU组无明显差别。稳定表达重组质粒pKB-GU-shC,pKB-GU-shB的PC12细胞中c-fos与junB的mRNA相对表达量分别为51%和49.73%。
本研究通过基因重组技术,分别成功构建了靶向c-fos与junBRNAi载体并成功筛选出不同干扰质粒的抗性克隆;通过RT-PCR技术,检测出上述干扰序列可以有效地抑制PC12细胞c-fos与junB的表达,为进一步在整体水平中研究c-fos及junB基因的功能提供了新的研究方法,在某种程度上为药物成瘾的分子机制研究提供了一个较好的体外细胞模型。
第二部分:肿瘤的发病机制涉及到多个信号通路,它们相互联系、相互作用,组成一个分子网络体系,因此针对单个靶点进行抗肿瘤治疗很有可能收效甚微。为了说明肿瘤多靶点治疗的重要意义,将同时靶向hEGFR和hTERT不同序列的16个pRS-G-T系列的双基因RNA干扰表达载体以及分别靶向hEGFR,hTERT的8个单基因RNA干扰载体及阴性对照质粒pRS采用Exgen500转染试剂瞬时转染肝癌细胞SMMC-7721,MTT检测细胞增殖抑制率,结果显示双基因RNAi载体pRS-shG4-T4和pRS-shG3-T4对肝癌细胞的抑制率均可达到40%左右。将对肝癌细胞SMMC-7721生长抑制效率最好的重组载体pRS-G4-T4,pRS-G3-T4以及在单基因RNAi中筛选出抑制基因表达效果最好的shRNA,组成的双基因载体pRS-G2-T2分别转染SMMC-7721细胞,48h后RT-PCR检测到细胞中的hEGFRmRNA相对表达量分别为0.9,0.843,0.538;hTERTmRNA的相对表达量分别为0.679,0.74,0.32。肿瘤的发病是一个复杂的分子网络疾病,为了进一步揭示肿瘤发病机制中各基因间的相互关联,利用RT-PCR技术进一步检测了与肿瘤密切相关的DNMT及H2AX两个基因的mRNA表达情况,结果显示DNMT及H2AX的mRNA表达与阴性对照载体pRS无差别。
由于肿瘤的多靶点治疗是由不同信号通路调节的病变细胞,所以关于肿瘤治疗的多靶点的选择以及明确与肿瘤相关基因间的联系有待进一步研究。