研究背景呼吸系统与外界环境直接连通,上呼吸道是微生物最常见的定植部位,由多种共生细菌和致病共栖菌寄居。呼吸道细菌定植是指细菌在气道黏膜上皮细胞或黏液分泌物中持续存在而无宿主不良反应的状态。细菌定植尚不是感染,但却是感染的最重要来源和最危险因素。人体呼吸系统作为与外界环境直接接触的身体最大的黏膜系统,在出生后5分钟内即可检测到细菌定植。呼吸道微生态系统受各种自身及环境因素的影响,处于动态变化过程中,儿童是呼吸道菌群发展的关键时期,生命早期微生物的定植可影响呼吸系统疾病的易感性、病情严重程度和远期预后。目前随着城市化进程的加速,生活环境的改变,空气污染的加重,疾病严重性及复杂性增加、医疗技术水平的发展、抗菌药物的大量使用、疫苗接种(肺炎球菌疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗)及各种侵袭性操作等,上皮细胞表面环境改变使致病菌易于粘附于口咽部粘膜,并对抗防御机制,进而易发生细菌的定植,在机体免疫力低下、常驻非致病性微生物群的异常竞争、病毒感染,导致呼吸道黏膜稳态改变、异常的局部炎症反应可能影响细菌从定殖到感染,引起呼吸道感染。儿童由于其独特的上呼吸道生理特点,是细菌定植的高发人群,同时也是社区呼吸道病原体的传播来源。儿童呼吸道疾病仍是全球儿童医院就诊及死亡的主要原因之一,目前国内关于呼吸道病原学研究主要针对患病者呼吸道病原学研究,对健康儿童呼吸道定植菌的研究较少,因此了解健康儿童呼吸道定植菌情况显得尤为重要。既往国外关于健康儿童呼吸道微生物多采用16SrDNA测序技术,但特异性低、检测仪器昂贵。本研究采用耗时短、特异性高、价格相对低廉的多重媒介探针熔解曲线分析技术(多重荧光PCR技术),以了解本地区0-6岁健康儿童上呼吸道细菌定植情况。研究目的探讨0-6岁健康儿童上呼吸道定植菌特点,了解0-6岁健康儿童上呼吸道定植菌与年龄、性别、季节及Hib疫苗接种之间的关系,为儿童呼吸道疾病早期治疗及预防提供参考。研究方法选取2018年7月至2019年7月在郑州大学第三附属医院预防接种门诊接种疫苗的0-6岁健康儿童1000例为研究对象,依据年龄,将入组儿童分为婴儿组(1月～<12月)、幼儿组(12月～<36月)、学龄前组(36月～<72月),在接种疫苗前由专业人员采集咽拭子。放入Hanks平衡盐溶液中,及时送检,若24小时不能送检则-20.0℃冷藏。本研究采用多重荧光PCR技术原理单管同步检测15种易导致呼吸道感染的定植菌(包括流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、烟曲霉菌、白色念珠菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、隐球菌、百日咳杆菌)。使用Microsoft Excel 2007软件包对数据进行录入和分析处理,检测结果以百分比(%)表示;采用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析,采用χ2检验或Fisher精确检验,以α=0.05为检验水准。研究结果1.上呼吸道定植菌总的检出情况纳入研究的1000例标本中,通过多重荧光PCR检测方法有402例标本检测出定植菌,总检出率40.2%。单一定植菌检出289例,检出率28.9%;混合定植菌检出113例,检出率21.3%,混合定植以两种细菌混合定植为主,共检出83例,其中以肺炎链球菌、流感嗜血杆菌混合定植检出率最高,肺炎链球菌、卡他莫拉菌混合定植居于其次。流感嗜血杆菌总检出率最高,为16.3%;肺炎链球菌总检出率15.6%,居于其次;卡他莫拉菌总检出率5.3%;金黄色葡萄球菌总检出率5.9%;表皮葡萄球菌总检出率3.3%;白色念珠菌总共检出率3.0%;鲍曼不动杆菌总检出率2.3%;化脓性链球菌总检出率2.2%;肺炎克雷伯菌总检出率1.8%;未检测到铜绿假单胞菌、大肠杆菌、隐球菌、百日咳杆菌、烟曲霉菌。2.不同年龄组健康儿童上呼吸道定植菌检出情况本研究中,婴儿组共284例,检测出定植菌的共101例,检出率35.6%,其中单一定植菌检出率28.5%;混合定植菌检出率(20例,7.0%),低于幼几组及学龄前组,组间比较有统计学意义(P<0.05);与其他年龄组相比,婴儿组表皮葡萄球菌检出率最高,差异有统计学意义(P<0.01)。幼儿组共322例,定植菌检出率40.4%,本组金黄色葡萄球菌检出率与学龄前组相同,高于婴儿组。学龄前组共394例,检测出定植菌174例,检出率44.2%,其中流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌检出率均高于婴儿组及幼儿组,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.不同性别健康儿童上呼吸道定植菌检出情况本研究共检测0-6岁健康儿童共521例,检测出定植菌203例,检出率38.9%;女性共479例,定植菌检出率41.5%,男性与女性定植菌检出差异无统计学意义。4.不同季节健康儿童上呼吸道定植菌检出情况本研究,春季共检测164例,阳性率36.5%;夏季共检测385例,检出率33.7%;秋季共检测207例,检出率47.3%;冬季共检测121例,检出率44.6%。研究显示,不同季节呼吸道定植菌检出率不同,秋、冬季节定植菌检出率高于春、夏季节,差异有统计学意义(P<0.01)。其中秋季混合定植率高于春、夏、冬季节,差异均有统计学意义(P<0.01);夏季金黄色葡萄球菌检出率高于其他三个季节,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);白色念珠菌、肺炎克雷伯菌在秋季检出率最高,差异有统计学意义(P<0.01);流感嗜血杆菌秋、冬季检出率较高,差异有统计学意义(P<0.01);卡他莫拉菌在秋、冬季节检出率较高,差异有统计学意义(P<0.01);肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、化脓性链球菌等无季节性差异。5.接种Hib疫苗对健康儿童上呼吸道定植菌的影响本研究1000例研究对象中180例接种Hib疫苗,506例未接种Hib疫苗,其中314例标本关于Hib接种信息不祥。接种疫苗组检测出定植菌60例,检出率33.3%;未接种疫苗组定植菌检出率42.1%。接种Hib疫苗组呼吸道定植菌、混合定植菌检出率均低于未接种Hib疫苗组,差异有统计学意义(P<0.05)。接种Hib疫苗组肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、化脓性链球菌检出率均低于未接种Hib疫苗组。结论1.1000例0-6岁健康儿童上呼吸道定植菌主要是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌。2.随着年龄增长,上呼吸道定植菌增加。3.不同季节上呼吸道定植菌不同,秋、冬季节定植菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌及混合定植菌均高于其他季节,而夏季金黄色葡萄球菌高于其他季节。4.接种Hib疫苗后上呼吸道定植菌降低。