金观音(C.sinensis cv.Jinguanyin)是以铁观音为母本、黄旦为父本,经人工杂交育成的茶树优良品种。金观音在芽叶颜色等农艺性状与亲本存在差异,茶叶产量、香气、适应性等性状超过父母本,杂种优势强。有关茶树杂种优势的遗传机理研究,目前只停留在亲子代间的形态特征、生理生化特性、制茶品质等方面,用遗传学理论来阐释茶树杂种优势的机理还鲜见报道。探究金观音及其亲本间表观与内在差异现象的分子机理、遗传规律、抗逆性相关基因的克隆,可以为茶树杂交育种的早期选择、茶树杂种优势形成理论、茶树抗逆性分子机制的解析提供理论依据。本研究以金观音及其母本铁观音和父本黄旦的春茶嫩梢为供试材料,采用DSN介导的抑制差减杂交技术,构建金观音-铁观音及金观音-黄旦两个正向差减cDNA文库,采用反向Northern-Blotting技术筛选这两个正向差减cDNA文库,获得差异基因的阳性克隆,将阳性克隆的测序结果进行生物信息学分析,预测其生物学功能,并将这些差异基因进行归类;采用荧光定量PCR技术检测金观音(杂种)与其亲本差异基因(与生长发育、抗性和品质相关)表达量的变化,分析差异基因的表达模式;采用RT-PCR和荧光定量PCR技术对筛选出具有超高亲表达和低于双亲表达模式的基因进行相互验证;采用荧光定量PCR技术,检测筛选出具有超高亲表达和低于双亲表达模式的基因在其他两个子一代黄观音和金玫瑰上表达量的差异,推测具有杂种优势等基因的双亲的基因型;从父本黄旦和子一代金观音抑制差减文库中获得的杂种优势基因中筛选出一条参与抗逆性相关的片段序列ENO,以铁观音芽叶为材料,克隆并验证该序列的全长编码cDNA序列,采用生物信息学软件对该序列进行分析,采用荧光定量PCR技术检测该抗逆性基因在4种逆境胁迫处理下的动态表达。研究结果如下:1.金观音与其亲本正向抑制差减cDNA文库的构建与筛选:两个正向差减文库的滴度分别为2.3 × 105 cfu/mL和3.5 × 105 cfu/mL,两个文库插入片段大小均在1～3 kb之间。采用反向Northern-Blotting技术,分别从金观音-铁观音和金观音-黄旦正向差减文库中筛选出90条和113条有效的单基因序列,其中共有基因为14个,76个差异基因的性状遗传黄旦,99个差异基因的性状遗传铁观音。这两个正向差减cDNA文库中均有筛出参与茶树生长发育、次生代谢、香气代谢、逆境胁迫、信号转导、能量代谢、生物调控、分子功能和细胞构成等基因。2.金观音与其亲本差异基因表达的遗传分析:与生长发育、抗性和品质形成有关的基因在金观音及其亲本中均有表达,依据表达量的差异可分为5种表达模式。从超高亲和低于双亲表达模式中随机筛选15个基因,采用RT-PCR和荧光定量PCR技术检测它们在金观音及其亲本上表达量的差异,结果表明这15个基因在不同样品间RT-PCR扩增产物条带亮度的强弱与荧光定量PCR检测的表达量高低趋势一致,说明这些基因具有超高亲表达量和低于双亲表达量的特点。根据金观音、黄观音和金玫瑰等3个子一代品种与其共同父母本的荧光定量表达量差异,可分为子一代品种的表达量均超过双亲(杂种优势)、低于双亲(杂种劣势)、部分超过双亲和部分低于双亲(兼具杂种优、劣势)3种类型,且每种类型对应的双亲基因型均不同。3.克隆并验证从杂种优势基因中筛选出的一条与抗性相关的片段序列:该序列全长1 753 bp,含有一个1 332 bp完整的开放阅读框,命名为CsENO,登录号KX962311。序列基因编码444个氨基酸,氨基酸序列分析发现,该cDNA与其他植物ENO高度保守,包含ENO特异结构域,与苹果(Malus domestica)、白梨(Pyrus × bretschneideri)的亲缘关系较近,相似性达84%。生物信息学预测结果显示,CsENO属于稳定、亲水蛋白,不存在跨膜结构,无信号肽,可能定位到其他亚细胞中,且具有多个磷酸化位点;二级结构主要由α-螺旋构成。实时荧光定量PCR结果表明,CsENO在低温、ABA、高盐、干旱逆境胁迫处理下均有表达且表达受到不同程度的诱导。