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目的：本课题组研究筛选香菇菌株C91-3,发现其菌丝体发酵液提取蛋白LFP91-3不仅具有体内抑制肿瘤生长作用还具有显著的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用。前期研究表明LFP91-3对小鼠腹水型肉瘤细胞(S180)生长具有抑制作用,本试验通过MTT方法验证LFP91-3对人宫颈癌细胞(Hela)体外培养同样具有直接杀伤作用,并进一步探讨了香菇C91-3发酵液蛋白对人宫颈癌细胞(Hela)和小鼠腹水型肉瘤细胞(S180)生长抑制作用过程中诱发Caspase-3.Caspase-8.Caspase-9蛋白活性的改变,同时流式细胞仪检测Caspase特异性抑制剂协同作用后细胞凋亡的变化加以验证。方法：(1)LFP91-3蛋白制备；(2)Hela、S180细胞传代培养；(3)MTT方法检测LFP91-3蛋白对Hela细胞体外抑制作用；(4)LFP91-3蛋白5μg／ml作用于对数生长期Hela、S180细胞,Caspase抑制剂Z-VAD-FMK协同作用对照样品24h、48h、72h,收集细胞,流式细胞仪分析其凋亡规律；(4)LFP91-3蛋白5μg／ml作用于对数生长期Hela、S180细胞,试剂盒检测Caspase-3.Caspase-8.Caspase-9蛋白表达。结果：香菇C91-3发酵液蛋白作用于Hela细胞,作用时间24h、48h、72h,作用浓度1μg／ml、5μg／ml、10μg／ml,最低生长抑制率18.621%,最高生长抑制率为51.583%,随着作用时间延长,生长抑制率明显增加,P<0.05。表明香菇C91-3发酵液蛋白对Hela细胞的生长抑制作用随着作用时间呈现剂量依赖性。流式细胞仪检测分析发现,与Caspase抑制剂Z-VAD-FMK协同干预作用细胞相比较,随着C91-3发酵液蛋白作用时间延长,Hela早期凋亡率由24h测定值5.55%、48h测定值6.80%至72h上升达到11.55%,而Caspase抑制剂Z-VAD-FMK干预作用细胞相应时间点早期凋亡率为1.16%、1.32%、2.41%,二者差异显著(P<0.01)；相应时间点启动启动型半胱天冬氨酸酶Caspase一8.Caspase一9随着香菇C91-3发酵液蛋白作用时间延长,蛋白活性增加,经试剂盒测定(Beyotime)测定其活性分别由24h蛋白活性测定值13.545±1.181、11.750±0.800作用48h上升至22.636±1.500、13.250±1.550,作用72h达到35.364±1.455、17.250±1.350。香菇C91-3发酵液蛋白作用于细胞24h,死亡执行者Caspase一3经试剂盒测定其蛋白表达6.043±0.086、作用时间48h蛋白活性测定值8.217±0.173,至72h蛋白活性测定值达到35.364±0.304,与凋亡率呈现相同增长趋势表达。与阴性对照相比较,香菇C91-3发酵液蛋白诱导作用于Hela细胞后, Caspase一3.Caspase-8、Caspase一9蛋白表达水平明显提高,差异具有显著性(P<0.01)。香菇C91-3发酵液蛋白体外作用于肿瘤细胞S180,其早期凋亡率由24h测定值5.86%至48h上升至7.51%,72h达到8.47%,Caspase抑制剂Z-VAD-FMK干预作用细胞早期凋亡率相应时间点为1.22%、2.08%、2.30%。由此可见,随着蛋白作用时间延长,肿瘤细胞凋亡与死亡明显增加,其早期凋亡率明显高于受Caspase抑制剂Z-VAD-FMK协同干预作用肿瘤细胞,二者差别具有显著性(P<0.01)。试剂盒(Beyotime)检测Caspase-3.Caspase-8.Caspase-9,发现香菇C91-3发酵液蛋白诱导时间由24h增至48h,再至72h,Caspase一9由1.25±0.350上升至4.25±0.15,72h达到7.25±0.550，而Caspase-8蛋白活性24h即达到53.091±2.331,Caspase一3则由8.652±0.086至上升至9.956±0.210,72h几近倍增达到16.478±1.087。与阴性对照相比较,香菇C91-3发酵液蛋白诱导作用于S180细胞后,Caspase一3.Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平明显提高,差异具有显著性(P<0.01)结论：香菇C91-3发酵液蛋白对肿瘤细胞Hela体外培养具有抑制作用(P<0.05),随着作用时间的延长,生长抑制率呈现剂量依赖性。香菇C91-3发酵液蛋白5μg／ml作用于肿瘤细胞Hela.S180,流式细胞仪分析随着作用时间延长细胞早期凋亡率显著增加,Caspase抑制剂Z-VAD-FMK干预作用细胞凋亡减少,香菇C91-3发酵液蛋白诱导肿瘤细胞凋亡,其凋亡率与Caspase抑制剂Z-VAD-FMK协同作用对照组相比,差异具有显著性(P<0.01)；试剂盒检测发现Caspase一3.Caspase一8、Caspase一9蛋白活性明显增加,香菇C91-3发酵液蛋白通过影响Caspase一3.Caspase一8.Caspase-9蛋白表达和活性诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥其抗肿瘤作用。