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富营养化最明显的表征之一是暴发蓝藻水华。蓝藻水华大规模持续暴发会严重影响水质和生态系统结构与功能,尤其在蓝藻衰亡降解过程中,藻细胞死亡分解耗氧过多会导致需氧生物缺氧死亡,还会释放有毒有害物质,如藻毒素、含氮化合物等。为了探讨蓝藻水华降解过程中形成的胁迫因子对水体中主要浮游动物类群枝角类的影响,本研究选择太湖常见种拟同形溞(Daphnia similoides)、同形溞(Daphnia similis)和生态毒理检测模式生物大型溞(Daphnia magna)为实验材料,通过低溶氧、氨、微囊藻毒素和亚硝酸盐对枝角类单一和复合暴露实验,研究水华衍生的胁迫因子对枝角类生活史参数及抗氧化酶基因表达的影响。主要结果如下：1.在不同溶氧水平对D. similoides影响的21天慢性实验中,观察了存活、生长及繁殖方面的生活史参数变化。发现低溶氧会减少D. similoides的存活时间、蜕皮次数、阻碍生长、推迟个体成熟和抑制繁殖,因此低溶解氧对D. similoides的生活史参数具有显著的负面效应。利用直角曲线模型能较好地拟合平均存活天数、蜕皮次数、繁殖窝数和总繁殖量随着溶氧梯度的变化。通过该模型分别得到上述参数的EC5o(半效应浓度)分别为2.45、2.95、2.40、3.29mg L-1,表明繁殖对低溶氧胁迫较敏感。由结果可推测,溶解氧的下降会对D. similoides种群产生不利的影响。2.把D. similis暴露于不同浓度非离子氨和低溶氧复合条件下14天,结果发现(1)低溶氧能减少D. similis的存活天数和蜕皮次数,同时在低溶氧下0.48mg L-1NH3显著影响存活和蜕皮；(2)非离子氨能显著推迟个体的性成熟时间并且抑制个体生长；(3)非离子氨和低溶氧都能抑制母体的繁殖能力,包括繁殖窝数、总繁殖量和平均繁殖量。因此,我们认为非离子氨能协同低溶氧对枝角类D. similis的生活史参数起到复合抑制作用。3.已报道的文献认为非离子氨,低溶氧,藻毒素等蓝藻胁迫因子会破坏水生动物物的抗氧化系统。本实验根据参照Tigriopus japonicas和Cherax quadricarinalus Mn-SOD基因,设计引物克隆出D. magna Mn-SOD (Dm-Mn-SOD)基因,随后研究了该基因在水华衍生胁迫因子藻毒素和亚硝酸盐刺激下的表达模式。Dm-Mn-SOD cDNA全长955bp,含有一个完整的开放阅读框,编码的多肽由共编码215个氨基酸,理论分子量为24594.24kDa,等电点为7.10。利用MEGA5.03软件对Dm-Mn-SOD编码的蛋白质序列进行分析计算遗传距离,采用邻接法构树,发现其与其他物种的线粒体Mn-SOD亲缘关系最近,而且利用ClustalW同源比对分析,发现Dm-Mn-SOD与Dromia personata (75%)、Cancer pagurus (75%)和Carcinus maenas (75%)都具有相似的同源性。利用Real-time PCR技术,检测在藻毒素和亚硝酸盐胁迫下的表达情况,发现较低的亚硝酸盐浓度和藻毒素都能上调Dm-Mn-SOD基因的表达。线粒体是细胞中能量合成的场所,Dm-Mn-SOD基因在保护机体,尤其是清除线粒体内的自由基起着重要作用,为维持细胞正常能量代谢提供保障。结合本研究基因表达的结果推测,亚硝酸盐和藻毒素能造成机体氧化胁迫,机体为了清除线粒体内过多的氧自由基,上调了Mn-SOD基因表达。4.为了从基因表达水平研究蓝藻水华衍生的胁迫因子对枝角类抗氧化酶系统的影响,本实验首先克隆出了水体污染物检测常见模式生物D. magna的Cu/Zn-SOD基因,随后研究了该基因在蓝藻水华衍生的两种胁迫因子非离子氨和低溶氧刺激下的表达模式。该基因全长cDNA序列已提交给GenBank,登录号为JX456347。D. magna Cu/Zn-SOD (Dm-Cu/Zn-SOD) cDNA全长537bp,含有一个完整的开放阅读框,编码的多肽由共编码178个氨基酸,理论分子量为16.11kDa,等电点为5.84。该多肽含有一个由21个氨基酸组成的信号肽,表明它是胞外Cu/Zn-SOD。通过多重序列比对发现该多肽有两个Cu/Zn结构域,各有四个Cu2+和Zn2+结合位点。通过同源性比对发现,Dm-Cu/Zn-SOD与Daphnia pulex (88%)、Alvinella pompejana (56%)和Cristaria plicata (56%)具有较高的同源性。利用Real-time PCR技术,检测Dm-Cu/Zn-SOD在非离子氨和低溶氧胁迫下的表达情况,发现较低的非离子氨浓度和低溶氧都能诱导Dm-Cu/Zn-SOD基因的表达。本实验说明,Dm-Cu/Zn-SOD是良好的水域毒理检测生物标记物,同时也为进一步研究枝角类抗氧化系统的响应机制提供了基础。5.在蓝藻水华积累及降解形成的低溶氧状况下,枝角类的生长和繁殖受到不同程度的抑制。为了解不同龄期(1、4、7、14天)D. magna对溶解氧急剧变化的耐受性,本研究采用急性毒性实验方法探讨了低溶氧对不同龄期D. magna经48小时暴露后存活情况。同时,检测D. magna体内hemoglobin (DHB)、α-esterase (EST)、catalase (CAT)、heat-shock protein70(HSP70)基因受到不同低溶氧胁迫的差异表达。(1)溶氧对不同龄期D. magna48小时存活率影响,结果表明日龄期越大的个体,对低溶氧胁迫越敏感,存活率越低,这可能是由于大龄个体所需的氧气量要比低龄个体多造成的；(2)不同龄期个体的DHB对溶氧变化的响应模式是相似的：随着溶氧降低呈显著性(p<0.05)“先升后降”趋势。DHB具有结合氧气分子并输送到机体全身的功能,一般情况下,外界溶解氧下降会刺激血球蛋白基因表达量上升,但溶解氧过度下降会抑制血球蛋白表达；(3)不同龄期个体的EST对溶氧变化的响应模式是不同的：1日龄个体EST表达量随着溶解氧下降而显著性上升(p<o.05)；4、7日龄个体EST表达量随着溶解氧下降呈“先升后降”趋势(p<0.05)；14日龄个体EST表达量随着溶解氧下降呈显著性下降p<0.05)；(4)不同龄期个体的CAT和HSP70对溶氧变化的响应模式是不同的：1、7日龄的个体CAT和HSP70随着溶解氧下降都呈显著性“先升后降”趋势(p<0.05)；4、14日龄个体CAT和HSP70随着溶解氧下降而显著性下降(p<0.05)。CAT和HSP70作为生物标记物能够敏感有效的表明低溶氧诱导大型溞产生的应激(氧化)反应。一定程度的低溶氧能刺激CAT和HSP70表达量上升；同时过低的溶解氧又会对机体造成损伤,抑制CAT和HSP70表达。