论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒感染(Hepatitis B virus, HBV)呈全球范围广泛流行,在我国尤为严重。HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎,并与肝硬化、肝癌的发生密切相关,是严重危害人类健康的感染性疾病。很多流行病学与实验证据表明HBV的感染与原发性肝细胞癌(Hepatocellular,HCC)的发生有很大的相关性。HBV携带者与非HBV携带者发生HCC的比例为200:1。HBV在肝癌的发生发展中发挥的作用是毋庸置疑的,但是其中具体的机制仍然不清楚。人类HBV属于嗜肝DNA病毒科,其基因组DNA为部分环状双螺旋结构,长约3.2kb。基因组中含有四个主要的相互重叠的开放读码框(Open reading frame,ORF),分别为S、C、P、X。S-ORF分为S基因、前S2区和前S1区,各有其起始密码ATG,C-ORF分为C基因和前C区,各有起始密码ATG,P-OFR是最长的读架,其开始区段与C-ORF重叠,中间与S-ORF重叠,最后区段与X-ORF重叠,X-ORF在nt1374-1837,adr亚型有27bp的短缩,为其中最小的一种ORF。X蛋白(pX)对转录有反式激活功能,在HBV介导的致癌作用中作为辅助因子发挥了重要作用,但具体的致癌机制仍不明确。目的:为了更好的研究pX的功能及在HCC的发生发展中的作用,我们运用基因敲入技术在人肝癌细胞株SMMC7721中构建稳定并且高效表达HBV X基因的细胞株,稳定细胞株的成功建立也同时为制备、纯化pX提供了良好的实验材料。也为稳定细胞系的构建提供了新的方法和视野。方法:通过电击转染将基因诱捕载体pU17导入到人类肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选,报告基因X-gal染色后得到X-gal高表达的阳性克隆;在这些高表达X-gal的阳性克隆中通过Cre-LoxP置换系统,把HBx基因敲入到细胞的染色体中,再通过基因组PCR、斑点杂交等方法检测HBx DNA的存在和pX蛋白质的表达。结果:得到永久性高表达诱捕载体报告基因X-gal的阳性克隆;用Cre-LoxP置换系统,将构建好的HBx全长片段与诱捕载体的报告基因部分交换,HBx全长片段完整地整合在SMMC7721细胞的染色体基因中,并能从该细胞系中检测到HBx抗原。结论:本实验提供了一种新的稳定表达pX的肝癌细胞系的建立方法。该细胞系为研究HBx在肝细胞癌发生、发展中的作用提供了理想的实验模型,同时也为制备、纯化X抗原和研究X基因调控提供了良好的实验材料。