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背景乳腺癌是一种常见的严重危害妇女身心健康的恶性肿瘤。调查数据显示,全球每年有120万妇女罹患乳腺癌,且有50万死于该病。在西欧、北美等发达国家,乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤首位,而在中国,发病率更是逐年攀升,并有年轻化趋势。尽管结合手术、化疗及放疗等治疗手段,乳腺癌预后仍较差。因此,应努力寻找新的治疗策略。B细胞特异的莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1,Bmi-1)基因是多梳基因家族成员,参与细胞增殖调控,对于造血干细胞自我更新及分化潜能的维持至关重要。研究发现Bmi-1基因在乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌及鼻咽癌等多种肿瘤细胞中高表达并与肿瘤的预后不良相关,下调Bmi-1的表达能有效抑制肿瘤细胞的生长和成瘤能力,提示Bmi-1可能参与肿瘤的形成,可能成为肿瘤潜在的治疗靶点。Bmi-1与乳腺癌关系密切,临床发现有约85%的侵袭性乳腺癌患者高表达Bmi-1,Bmi-1的表达水平与乳腺癌恶性程度和转移能力相关;实验中也发现上调Bmi-1的表达能通过增加端粒酶活性恶性转化人乳腺上皮细胞。化疗在乳腺癌的治疗中占有重要地位,尤其对复发、转移性乳腺癌化疗更成为主要的治疗手段。然而,肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性往往严重影响化疗药的疗效。目前许多研究提示化疗药主要通过促进凋亡而达到治疗乳腺癌的效果。阿霉素(doxorubicin)是临床上广泛使用的抗肿瘤化疗药,是乳腺癌化疗的一线药物。在乳腺癌治疗中,单药阿霉素有效率仅为34%,心脏毒性是主要剂量限制性因素之一。因此,需要寻找一种增加阿霉素敏感性,使乳腺癌细胞易于发生凋亡从而减小其用量,降低不良反应的新策略。本课题研究RNA干扰(RNA interference, RNAi)沉默Bmi-1基因表达对乳腺癌细胞株MCF-7生物学特性及阿霉素敏感性的影响,研究结果有望为寻找乳腺癌治疗的新靶点和途径提供理论依据,具有重要的临床意义。目的研究RNAi沉默Bmi-1基因表达对MCF-7细胞生物学特性的影响,探讨其在乳腺癌发生发展中的作用。在此基础上,研究沉默Bmi-1表达对MCF-7细胞及移植瘤阿霉素敏感性的影响及机制。本研究按以下三部分进行。1.逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si沉默Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响。方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7细胞,表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)shRNA的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照。转染48h后用RT-PCR和western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡的变化;western blot检测蛋白p53,cyclinD1和p21的表达。结果:转染质粒pSuper-retro/Bmi-1si的Bmi-1si组Bmi-1 mRNA及蛋白表达明显下降,mRNA及蛋白水平的抑制率分别为:65.4%和72.3%,与对照组相比具有显著性差异(p<0.05)。MTT结果显示:与control组和GFPsi组相比,沉默Bmi-1基因表达使MCF-7细胞增殖速率受到明显抑制(p<0.05)。FCM检测发现:Bmi-1si组G1期及S期细胞比率分别为77.10%和17.17%,control组和GFPsi组G1期细胞比率分别为63.75%和64.84%,S期细胞比率分别为32.95%和29.90%,GFPsi组与control组相比无明显差异。与control组和GFPsi组比较,Bmi-1si组G1期细胞明显增多,S期细胞减少,比较具有统计学意义(P<0.05)。与control组和GFPsi组相比,Bmi-1si组细胞p53表达增加,cyclinD1表达明显减少,p21表达明显增加,差异显著(P<0.05),而GFPsi组与control组相比无明显差异(P>0.05)。转染48h后细胞早期凋亡的检测结果显示:Bmi-1si组细胞的凋亡率为4.94%,GFPsi组的凋亡率为2.84%。Bmi-1si组与GFPsi组及control组(凋亡率为3.18%)相比差异均无显著性( P>0.05 )。结论:重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能有效沉默MCF-7细胞Bmi-1基因表达。沉默Bmi-1基因表达可明显抑制MCF-7细胞增殖速率,可通过上调p53和p21表达和下调cyclinD1表达而引起MCF-7细胞周期异常,使细胞周期停滞于G1期。2.沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性与阿霉素敏感性研究。方法:pSuper-retro/Bmi-1si质粒经PT67细胞包装后产生的逆转录病毒感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株MCF-7/Bmi-1si,通过RT-PCR和western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达以鉴定;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭和转移能力;MTT法检测阿霉素的半数抑制浓度(IC50);DAPI检测阿霉素处理后细胞的凋亡;western blot测蛋白p53,Bcl-2,Bax,pAkt,tAkt的表达。结果:MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,Bmi-1 mRNA和蛋白表达量明显减少,抑制率分别为72.1%和76.7%,差异具有统计学意义(P<0.05)。MCF-7/Bmi-1si组克隆形成数及形成率较MCF-7和MCF-7/GFPsi组明显减少(P<0.05)。侵袭实验结果表明:MCF-7,MCF-7/Bmi-1si和MCF-7/GFPsi 3组细胞在Transwell侵袭小室中24h穿膜细胞数比较,MCF-7/Bmi-1si组明显减少,差异具有显著性(P<0.05)。转移实验结果也表明:在没有铺Matrigel的情况下,MCF-7/Bmi-1si组24h穿膜细胞数与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比明显减少(P<0.05)。阿霉素处理72h后MTT法检测IC50显示:MCF-7/Bmi-1si组生长抑制率(IR)明显高于MCF-7和MCF-7/GFPsi组,差异具有显著性(P<0.05)。MCF-7/Bmi-1si组和MCF-7/GFPsi组的IC50分别为0.15±0.02μg/ml和0.81±0.02μg/ml,而MCF-7组的IC50为0.87±0.06μg/ml。MCF-7/Bmi-1si组的IC50明显低于MCF-7和MCF-7/GFPsi组(P<0.05)。各组细胞分别用1μg/ml阿霉素处理48h后DAPI检测凋亡发现,MCF-7/Bmi-1si组凋亡指数高可见大量凋亡细胞,凋亡细胞呈现染色质浓缩、边缘化及分割成块状等典型的凋亡形态,而MCF-7和MCF-7/GFPsi组出现较少的凋亡细胞,凋亡指数较低。MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比差异显著(P<0.05)。阿霉素处理后的MCF-7/Bmi-1si、MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,MCF-7/Bmi-1si+doxorubicin组p53表达量增加,tAkt表达未发生改变,而pAkt的表达明显减少,另外,Bcl-2表达量减少而Bax表达量增加,差异具有显著性。MCF-7+doxorubicin和MCF-7/GFPsi+doxorubicin组相比,上述蛋白的表达量均无显著差异。结论:沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株构建成功;Bmi-1基因表达的沉默能显著降低MCF-7细胞的体外增殖及侵袭转移能力;还能通过促进凋亡增加MCF-7细胞对阿霉素的敏感性。3.沉默Bmi-1基因表达对MCF-7细胞成瘤及移植瘤阿霉素敏感性的影响。方法:将第二部分构建的稳定细胞株MCF-7/Bmi-1si、MCF-7/GFPsi及MCF-7分别接种到裸鼠背部右侧皮下,以直径大于0.5cm为成瘤标准,定期观察裸鼠肿瘤生长情况,测量计算肿瘤体积。在接种后28d处死裸鼠,称瘤重,计算肿瘤抑制率,观察肿瘤组织病理改变及Bmi-1表达。为了探讨在动物模型上沉默Bmi-1基因表达对阿霉素敏感性的影响,将36只裸鼠随机分为3组分别接种MCF-7/Bmi-1si,MCF-7/GFPsi和MCF-7细胞,在接种后的15d,将每组成瘤裸鼠又分别随机分为两组注射阿霉素或生理盐水,观察记录肿瘤的生长及体积变化;注射阿霉素后的21d处死裸鼠后称瘤重,计算肿瘤抑制率;检测肿瘤组织细胞凋亡。结果:MCF-7/Bmi-1si,MCF-7/GFPsi和MCF-7组细胞接种裸鼠后,成瘤时间分别为:8.7d、6.0d、5.4d。与MCF-7/GFPsi和MCF-7相比,MCF-7/Bmi-1si细胞成瘤时间明显延长,且肿瘤生长缓慢,肿瘤的体积和重量均较小,差异具有统计学意义(P<0.05)。接种MCF-7/GFPsi和MCF-7细胞所形成的肿瘤,肿瘤细胞体积大,胞浆丰富,核深染,肿瘤组织中Bmi-1的表达较弱。而MCF-7/Bmi-1si组肿瘤结构松散,细胞排列杂乱,肿瘤组织中Bmi-1的表达强。MCF-7/Bmi-1si+doxorubicin组肿瘤生长速度和体积与MCF-7+doxorubicin,MCF-7/GFPsi+doxorubicin组相比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。MCF-7/Bmi-1si组的相对肿瘤增殖速率(药物处理组和对照组相对肿瘤体积之比,即T/C比值)明显低于MCF-7/GFPsi和MCF-7肿瘤组。阿霉素处理21d后,MCF-7/Bmi-1si+doxorubicin组肿瘤重量与生理盐水对照组MCF-7/Bmi-1si+normal saline相比明显下降,肿瘤抑制率为63.3%。而MCF-7+doxorubicin,MCF-7/GFPsi+doxorubicin组的肿瘤抑制率分别为35.2%和37.8%。TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡结果显示:MCF-7/Bmi-1si+doxorubicin组凋亡信号明显增多,凋亡指数明显大于MCF-7+doxorubicin和MCF-7/GFPsi+doxorubicin组(P<0.05)。结论:沉默Bmi-1基因表达能明显降低MCF-7细胞致瘤作用;还可通过增加肿瘤组织凋亡提高阿霉素抗移植瘤效应。