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研究背景和目的环孢素A(Cyclosporine,CsA)是一种广泛应用的免疫抑制剂,它的临床应用极大地提高了实体器官移植术后患者和移植物的存活率[1]。然而,CsA的肝肾毒性严重限制其临床应用[2]。孕烷X受体(PXR)是一种配体激活的转录因子,参与多种药物代谢酶和转运体的调节,包括CsA的体内代谢酶CYP3A4和CYP3A5[3]。我们前期研究提示核受体PXR[4]及药物代谢酶CYP3A4、CYP3A5[5]某些位点的基因多态性可能与CsA导致的肝损伤相关,CYP3A5*3等位基因是CsA肝损伤发病的危险因素,而CYP3A4*18B等位基因是CsA所致肝损伤的保护性因素。体外实验表明,CsA可抑制HepG2细胞中PXR及其靶基因CYP3A4、CYP3A5的蛋白表达。对HepG2细胞中的PXR、CYP3A基因进行稳定干扰后,CsA对HepG2细胞的毒性加重[6]。结合前期的研究结果,我们推测PXR-CYP3A通路可能在CsA介导的肝损伤中起关键作用。目前,国内外尚未见PXR-CYP3A通路与CsA致肝损伤的相关报道。本课题在前期研究的基础上,以HepG2为体外模型,继续深入探讨PXR-CYP3A通路在CsA诱导的肝损伤中的作用及其分子机制,对于减少肝损伤发生及实现CsA个体化用药具有重要意义。方法:1、采用PXR激活剂利福平(Rif)、PXR抑制剂酮康唑(KTZ)预处理HepG2细胞24h后,加入不同浓度的CsA共同作用一定时间。同时将不同浓度的CsA分别作用于HepG2细胞、PXR稳定过表达细胞和PXR稳定干扰细胞一定时间。2、采用CCK8法测定细胞活力,探究CsA对HepG2的细胞活力的影响及PXR在CsA诱导的细胞毒性中的作用。3、测定细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)的含量,探究CsA对HepG2的细胞损伤作用,并分析PXR对CsA诱导的细胞损伤的影响。4、qRT-PCR 和 Western blot 检测PXR及其靶基因 CYP3A4、CYP3A5的mRNA及蛋白表达水平,探究肝损伤模型中诱导及抑制、稳定干扰及过表达PXR后CsA对CYP3A4、CYP3A5的转录及蛋白表达的调控作用,进一步研究PXR在CsA诱导的HepG2损伤中的作用机制。结果:1、与Control细胞比较,PXR稳定干扰细胞中PXR的mRNA及蛋白表达明显下降(p<0.01),PXR稳定过表达细胞中PXR的mRNA及蛋白表达明显升高(p<0.01)。2、在1～100μM范围内,随着CsA给药浓度的升高和给药时间的延长,HepG2的细胞活力下降(p<0.01)。经KTZ预处理或低表达PXR的HepG2细胞中,相同的CsA给药浓度下,细胞活力下降(p<0.01)。而经Rif预处理或高表达PXR的HepG2细胞中,相同的CsA给药浓度下,细胞活力升高。3、在5～50μM范围内,随着CsA给药浓度的升高,LDH、AST均呈浓度依赖性升高(p<0.01)。经KTZ预处理或低表达PXR的HepG2细胞中,相同的CsA给药浓度下,LDH、AST升高(p<0.01)。而经Rif预处理或高表达PXR的HepG2细胞中,相同的CsA给药浓度下,LDH、AST下降(p<0.01)。4、在5～50μM范围内,随着CsA给药浓度的升高,PXR、CYP3A4、CYP3A5的转录及蛋白表达呈浓度依赖性下降(p<0.01)。经Rif预处理或高表达PXR的HepG2细胞中,CsA对CYP3A4、CYP3A5的抑制效应明显低于对照组。而经KTZ预处理或低表达PXR的HepG2细胞中,CsA对CYP3A4、CYP3A5的抑制效应明显高于对照组。结论:1、PXR稳定干扰细胞株及PXR稳定过表达细胞株构建成功。2、CsA对HepG2的细胞毒性呈浓度依赖性和时间依赖性。3、CsA可引起HepG2细胞损伤,表现为LDH、AST的升高。4、CsA的细胞毒性和损伤程度与PXR的表达水平相关。增加CsA的给药浓度、抑制或低表达PXR可增强CsA的细胞毒性和细胞损伤,反之,降低CsA的给药浓度、激活或高表达PXR可降低CsA的细胞毒性和细胞损伤。5、CsA是PXR的配体,同时也是PXR和CYP3A的抑制剂。CsA通过PXR途径介导CYP3A4、CYP3A5转录及蛋白表达的下调,这可能导致CsA代谢的减少,积累增多,加重CsA的肝损害。综上所述,PXR-CYP3A代谢通路在CsA引起的肝毒性中具有重要的作用,可能是CsA所致药物性肝损伤的作用靶点之一。PXR、CYP3A激活剂可能可以作为预防和治疗CsA所致肝损伤的前景药物,而合用PXR、CYP3A抑制剂可能存在潜在的药物相互作用,临床上应予以注意。